TIPE2在T細(xì)胞介導(dǎo)的心臟移植急性排斥反應(yīng)中的潛在作用

趙越 ，徐雙悅韓蔚民莊國(guó)洪齊忠權(quán) （.廈門大學(xué)器官移植研究所，福建省器官與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 6005；.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝膽外科，慢性肝病肝癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 6005；.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 50004）

器官移植被認(rèn)為是治療器官衰竭的最有效手段［1-3］，然而，移植后的免疫排斥反應(yīng)一直是影響移植物生存的主要障礙［4-5］。目前，通過(guò)抑制急性排斥反應(yīng)，能夠較好地延長(zhǎng)移植物的生存期。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在急性免疫排斥反應(yīng)中起到了重要的作用［6-7］。因此，深入研究免疫排斥反應(yīng)的分子機(jī)制，有利于臨床尋找新的靶點(diǎn)治療，緩解T細(xì)胞介導(dǎo)的急性免疫排斥反應(yīng)，從而延長(zhǎng)移植物的生存期。

腫瘤壞死因子-α-誘導(dǎo)蛋白8樣因子-2（tumor necrosis factor-α-induced Protein-8-like-2，TN-FαIP8L2/TIPE2）是腫瘤壞死因子-α-誘導(dǎo)蛋白8家族成員之一，作為免疫負(fù)調(diào)控分子，它在固有免疫以及細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要作用［8］。TIPE2主要在免疫系統(tǒng)中高表達(dá)，具有維持免疫平衡和防止免疫過(guò)反應(yīng)的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，TIPE2主要在淋巴組織中高表達(dá)，但是在內(nèi)分泌組織和骨骼肌中也可以檢測(cè)到TIPE2的表達(dá)［9］，而在眾多的腫瘤細(xì)胞系中TIPE2不表達(dá)或是表達(dá)量低。近幾年，越來(lái)越多文獻(xiàn)報(bào)道TIPE2與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等相關(guān)［10-12］。

在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中，TIPE2在外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)量明顯下降，說(shuō)明TIPE2在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要［13］。在移植方面，有文獻(xiàn)表明相對(duì)于正常腎組織，慢性排斥組的腎移植物TIPE2表達(dá)量明顯下降，急性排斥反應(yīng)組TIPE2表達(dá)量輕微下降［14］。但在心臟移植中TIPE2的表達(dá)情況以及作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，同種異體心臟移植物中TIPE2表達(dá)量上升，這與浸潤(rùn)心臟內(nèi)的T細(xì)胞有關(guān)，提示了TIPE2與T細(xì)胞介導(dǎo)的急性免疫排斥反應(yīng)可能具有一定的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料：8 ～ 12周雌性C57BL/6以及BALB/c小鼠（上海Slac實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；流式抗體FITC-anti-CD4、PE-anti-CD8（美國(guó)Biolegend公司）；免疫熒光抗體anti-CD4、anti-CD8、anti-TIPE2（加拿大Invitrogen公司）；FITC和PE標(biāo)記的抗兔抗體（加拿大Invitrogen公司）；實(shí)時(shí)定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增試劑盒及TRIzol（日本Takara公司）；全部引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟移植：我們實(shí)施的是血管異位心臟移植術(shù)，將供體心臟的主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈與受體的頸總動(dòng)脈及頸外靜脈采取套管法連接［15］。實(shí)驗(yàn)分為兩組（同種同系組和同種異系組），同種同系組（n＝3）：將C57BL/6小鼠的心臟異位移植到另一只C57BL/6小鼠頸部；同種異系組（n＝3）：將BALB/c小鼠的心臟異位移植到C57BL/6小鼠頸部。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心臟移植物中CD4+與CD8+T細(xì)胞：同種同系組及同種異系組小鼠心臟移植物在第7天取出，研磨勻漿后過(guò)濾，標(biāo)記FITC-anti-CD4、PE-anti-CD8抗體，標(biāo)記好后用來(lái)自德國(guó)Partec 公司的FACScan儀器進(jìn)行檢測(cè)，所獲得數(shù)據(jù)通過(guò)FlowJo軟件進(jìn)行處理。

1.2.3 心臟移植物切片及HE染色：第7天時(shí)取出受體小鼠的心臟移植物，浸泡在10%福爾馬林中，石蠟包裹后切成5 μm的切片，最后用HE染色制片。

1.2.4 免疫熒光：同種異系組小鼠脾臟在移植后7天取出，研磨提取脾細(xì)胞后涂片，用4%多聚甲醛泡15分鐘，PBS洗滌液洗兩次，然后用0.2%Triton X-100沖洗5分鐘。5%脫脂牛奶阻斷30分鐘，然后用CD4、CD8及TIPE2多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，過(guò)夜后切片用FITC和PE標(biāo)記的抗兔抗體37℃黑暗孵育1小時(shí)。然后，（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。最后，通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)TIPE2、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和γ-干擾素（interferon-γ，INF-γ）的表達(dá)：引物序列設(shè)計(jì)：TIPE2上游引物為5'- CACCCAAGTCACATGACCGC-3'，下游引物為 5'- GAGCCCATCACAGATCTTGC- 3'， IL-2 上游引物為 5'- GGAGCAGCTGTTGATGGACCTAC -3'，下游引物為5'- AATCCAGAACATGCCGCAGAG- 3'，INF-γ上游引物為5'- CGGCACAGTCATTG AAAGCCTA-3'，下游引物為5'- CGGCACAGTCA TTGAAAGCCTA-3'。以β- actin為內(nèi)參對(duì)照，上游引物 為 5'- CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物為5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。研磨心臟組織勻漿后，按TRIzol說(shuō)明書提取總RNA，測(cè)純度和濃度，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后按SYBR Green說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果由SDS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 第7天心臟移植物破壞程度及T細(xì)胞浸潤(rùn)情況（圖1）：第7天時(shí)，收取同種同系組和同種異系組小鼠的移植心臟，行切片及HE染色，鏡下發(fā)現(xiàn)第7天時(shí)同種同系組的移植心臟組織肌纖維沒(méi)有受到破壞，沒(méi)有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而在同種異系組小鼠的移植心臟中，我們可以看到明顯的心肌組織受損和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)，充分研磨心臟組織勻漿后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，作為介導(dǎo)急性炎癥排斥反應(yīng)的重要免疫細(xì)胞T細(xì)胞，在小鼠的移植心臟中，CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)均增多（圖2）。

圖1 心臟移植物HE染色結(jié)果

2.2 TIPE2在心臟移植物及T細(xì)胞中的表達(dá)情況（圖3）：從第7天的小鼠心臟移植物中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于同種同系組，同種異系組小鼠的心臟TIPE2表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，因?yàn)門IPE2主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)，而T細(xì)胞又是介導(dǎo)急性排斥反應(yīng)的主要細(xì)胞，因此，我們推測(cè)心臟移植物中的TIPE2可能主要來(lái)自T細(xì)胞。我們?nèi)〉?天移植小鼠脾臟提取脾細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)定位CD4+/CD8+和TIPE2的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在CD4+或CD8+的T細(xì)胞中，同樣高表達(dá)TIPE2，這解釋了心臟移植物中TIPE2的升高可能來(lái)自浸潤(rùn)的T細(xì)胞。

圖2 心臟移植物流式檢測(cè)CD4+及CD8+T細(xì)胞

2.3 心臟移植物中細(xì)胞因子明顯上調(diào)（圖4）：TIPE2作為免疫負(fù)調(diào)控因子，對(duì)于免疫細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌有著直接的影響。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，由T細(xì)胞介導(dǎo)分泌的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ均在小鼠移植心臟中出現(xiàn)明顯的上調(diào)，提示了T細(xì)胞中TIPE2的表達(dá)可能與T細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌具有一定的關(guān)系，從而介導(dǎo)了急性排斥反應(yīng)過(guò)程的發(fā)生。

圖3 a為Real-time PCR檢測(cè)同種同系組，同種異系組小鼠第7天心臟移植物TIPE2表達(dá)水平；b為脾細(xì)胞免疫熒光染色CD4+、CD8+及TIPE2；與同種異系組相比，cP＜0.001

圖4 a、b為Rea-ltime PCR檢測(cè)同種同系組、同種異系組小鼠第7天心臟移植物IL-2和IFN-γ表達(dá)水平，與同種異系組相比，cP＜0.01，dP＜0.05

3 討 論

作為腫瘤壞死因子-α-誘導(dǎo)蛋白8家族的一員，TIPE2主要在造血以及淋巴組織中高表達(dá)，在穩(wěn)定免疫平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［16-17］。在心臟移植排斥反應(yīng)過(guò)程中，正是由于免疫平衡被打破，T細(xì)胞識(shí)別受體心臟抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致移植物的失活［18］。我們前期通過(guò)一些研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞介導(dǎo)的急性免疫排斥與TIPE2之間可能存在一定的相關(guān)性，但其具體分子機(jī)制仍不明確。

我們發(fā)現(xiàn)在小鼠心臟移植第7天，同種異系組的心臟移植物TIPE2表達(dá)量明顯高于同種同系組，而TIPE2表達(dá)量的提升正是由于介導(dǎo)急性免疫排斥反應(yīng)的T細(xì)胞浸潤(rùn)心臟組織而導(dǎo)致的。在心臟移植物中，浸潤(rùn)的CD4+及CD8+T細(xì)胞可分泌眾多細(xì)胞因子，例如IL-2和IFN-γ等，導(dǎo)致排斥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)擴(kuò)大，最終導(dǎo)致心臟移植物的失活［19-20］。Huang等［21］報(bào)道當(dāng)T細(xì)胞中的TIPE2下調(diào)以后，能明顯促進(jìn)IL-2和IFN-γ的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠心臟移植第7天，心臟移植物中的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ表達(dá)量明顯增高，所以我們推測(cè)，TIPE2能通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞在心臟移植物中細(xì)胞因子的分泌，從而影響急性免疫排斥的過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)中，心臟移植物中的T細(xì)胞表達(dá)TIPE2，是心臟移植物TIPE2表達(dá)增高的主要原因，也提示了TIPE2與T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)間的關(guān)系，能夠?yàn)橐院笈R床治療提供治療靶點(diǎn)，然而尚需進(jìn)一步研究TIPE2與T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)間的分子機(jī)制。