HO-1修飾的BMMSC對(duì)大鼠小腸移植免疫功能的影響

宋紅麗，楊洋，尹明麗，鄭衛(wèi)萍，劉濤，董沖，沈中陽(yáng)（.天津市第一中心醫(yī)院器官移植外科，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津3009；.天津市第一中心醫(yī)院，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3009）

小腸移植（small bowel transplantation，SBT）是公認(rèn)的能夠挽救小腸功能衰竭合并全胃腸外營(yíng)養(yǎng)并發(fā)癥患者的有效治療手段［1-2］。但由于小腸富含淋巴組織以及腸腔內(nèi)存在大量細(xì)菌，小腸移植排斥反應(yīng)明顯，目前尚無(wú)有效的控制手段?，F(xiàn)有的免疫抑制治療效果不佳，并會(huì)帶來(lái)一些相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，如惡性腫瘤、感染及高額費(fèi)用等，這些將會(huì)嚴(yán)重影響小腸移植受者長(zhǎng)期的存活率，也制約了小腸移植事業(yè)的發(fā)展。免疫耐受是一種受體免疫系統(tǒng)對(duì)移植物長(zhǎng)期特異性的不應(yīng)答狀態(tài)，仍然具有正常的針對(duì)其他外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答能力。因此，如何誘導(dǎo)一種持久穩(wěn)定且無(wú)需藥物的免疫耐受是迫切需要解決的問題［3］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）在器官移植中具有重要的應(yīng)用價(jià)值［4］。BMMSC具有低免疫原性，對(duì)于抑制器官移植后T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥具有一定的效果［5-6］。其能夠通過分泌一些免疫抑制細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素 -10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等以及干擾輔助性T淋巴細(xì)胞的分化來(lái)誘導(dǎo)免疫耐受［7-8］，是一種具有應(yīng)用前途的治療方法。但也有報(bào)道單純BMMSC輸注在組織內(nèi)的活性偏低［9］，而研究證明，應(yīng)用基因工程方法干預(yù)BMMSC的基因表達(dá)是一個(gè)有效的方法［10］。血紅素加氧酶1（hemeoxygenase 1， HO-1）是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性因子，參與器官移植后免疫耐受的調(diào)控過程［11］。HO-1可以轉(zhuǎn)染到BMMSC上，并增強(qiáng)BMMSC的活性，從而增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力，同時(shí)還可以延長(zhǎng)其作用時(shí)間［12］。

本研究在單純應(yīng)用BMMSC保護(hù)小腸移植排斥反應(yīng)的基礎(chǔ)上，以腺病毒為載體將大鼠HO-1基因體外轉(zhuǎn)染BMMSC形成HO-1/BMMSC，研究其對(duì)大鼠異位小腸移植排斥反應(yīng)的影響，探討HO-1是否能增強(qiáng)BMMSC在移植免疫中的調(diào)節(jié)作用以及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)器材：DMEM/F12（1：1）培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（PAA，澳大利亞），谷氨酸胺、青霉素/鏈霉素雙抗混合液（Gibco，美國(guó)），胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖溶液（Sigma，美國(guó)），10×紅細(xì)胞裂解液（BD，美國(guó)），大鼠IL-10、TGF-β、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素 -17（interleukin-17，IL-17）、白細(xì)胞介素-23 （interleukin-23，IL-23）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（Santa cruz biotechnology，美國(guó)），表達(dá)大鼠HO-1的重組腺病毒 （上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，中國(guó)）。Leica c0269手術(shù)顯微鏡（Leica microsystems AG，德國(guó)），顯微手術(shù)器械 （金鐘醫(yī)療器械，中國(guó)），正置熒光顯微鏡（Nikon Ni-U，日本），流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Bio Tek Synergy 2，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及處理：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)健康雄性BN大鼠（RT-1n）及雄性Lewis大鼠（RT-11），BN大鼠體重180～200 g，Lewis大鼠200～220 g。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后置于光照與黑暗每12小時(shí)循環(huán)的環(huán)境，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。以BN大鼠為供體，Lewis大鼠為受體，建立異基因（allogeneic，Allo）急性排斥反應(yīng)模型，實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)后經(jīng)陰莖背靜脈注射生理鹽水或細(xì)胞，供受體術(shù)前分別禁食24小時(shí)和12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水 （NS） 組、BMMSC組和HO-1/BMMSC組，每組分別在0、1、5、7、10天各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配5只實(shí)驗(yàn)鼠。實(shí)驗(yàn)各組均選擇輸注細(xì)胞5×106/ml劑量（1 ml/只鼠），對(duì)照組輸注NS（1 ml/只鼠）。觀察移植術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死的實(shí)驗(yàn)大鼠，收集外周靜脈血及組織標(biāo)本。

1.2.1 異位小腸移植動(dòng)物模型的建立方法同之前的研究［7］。將供體小腸的腸系膜上動(dòng)脈及門靜脈分別于受體大鼠的腹主動(dòng)脈及下腔靜脈做端側(cè)吻合。吻合完畢后開放血流，于下腹兩側(cè)腹壁分別戳孔將移植腸兩斷端牽引出腹腔行造瘺。溫生理鹽水沖洗腹腔后關(guān)腹?？緹艏訙乇Ｅ潦荏w大鼠清醒。

1.2.2 受體術(shù)后護(hù)理：術(shù)后給予單籠喂養(yǎng)，清醒后即可自由飲水，12小時(shí)后給予自由進(jìn)食。定期清洗消毒籠具并更換敷料保持清潔。每天至少巡視3次，對(duì)堵塞的造瘺口進(jìn)行護(hù)理。觀察移植大鼠術(shù)后的生存狀態(tài)并記錄各組大鼠生存時(shí)間。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BMMSC的提取、培養(yǎng)以及HO-1轉(zhuǎn)染BMMSC與驗(yàn)證的方法參照我們之前的研究［10］。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色檢測(cè)HO-1/BMMSC中HO-1的表達(dá)，步驟如下：將滅菌后的蓋玻片置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿底部，取5 ml 腺病毒載的HO-1轉(zhuǎn)染的BMMSC懸液（密度為1×106/ml）加入培養(yǎng)皿進(jìn)行爬片；待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后用PBS漂洗3次；4%多聚甲醛處理20分鐘，漂洗；0.5% Txiton X-100室溫處理20分鐘，漂洗；3% H2O2室溫處理15分鐘，漂洗；100 ml/L正常羊血清封閉液封閉l小時(shí)；在玻片上滴加濃度為1：100的兔抗鼠HO-1抗體，4℃冰箱過夜；漂洗后滴加濃度為1：400的PE標(biāo)記的羊抗兔免疫熒光抗體，37℃水浴箱中避光孵育1小時(shí)；漂洗后封片，于熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。

1.3.2 組織病理學(xué)檢測(cè)及急性排斥反應(yīng)評(píng)分：分別于術(shù)后1、5、7、10天搜集各組移植腸標(biāo)本行組織病理學(xué)檢測(cè)，光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)改變，按急性排斥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)排斥反應(yīng)程度進(jìn)行評(píng)分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野觀察兩組動(dòng)物在各時(shí)間點(diǎn)的病理改變，并根據(jù)Wu等［13］報(bào)道的小腸移植排斥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排斥反應(yīng)評(píng)分。此標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)黏膜層及黏膜下層細(xì)胞浸潤(rùn)、腺窩上皮損傷、腺窩調(diào)亡小體形成、結(jié)構(gòu)破壞及黏膜潰瘍程度，將小腸移植排斥反應(yīng)程度劃分為不明確的、輕度的、中度的以及重度的排斥反應(yīng)。

1.3.3 受體大鼠NK細(xì)胞活性檢測(cè)：提取各組受體鼠脾臟淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞YAC-1細(xì)胞共培養(yǎng)，通過測(cè)定乳酸脫氫酶的釋放量計(jì)算NK細(xì)胞的活性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組間差異。

1.3.4 免疫相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢測(cè)各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)血清的IL-10、TGF-β、IL-2、IL-17、IL-23及TNF-α的水平。具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟Tregs水平：分離受體鼠脾淋巴細(xì)胞，PBS重懸至1×107/ml，取0.1 ml分別加入抗 CD4 抗體 0.5 μl，抗 CD25 抗體 0.625 μl，4℃避光孵育30分鐘。PBS洗滌后加入穿孔素1 ml，4℃避光孵育過夜。PBS洗滌并定容至0.1 ml，加入抗Foxp3抗體5 μl，4℃避光孵育2小時(shí)。PBS洗滌后固定于4%的多聚甲醛等待上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其中CD4+、CD25+、Foxp3+和Tregs的變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組間差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析：用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖片制作，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（19.0版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)比較如為兩組間的，則用Student'st檢驗(yàn)；如為3組及以上，則用單因素方差分析 （One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外提取BMMSC和制備HO-1/BMMSC

2.1.1 大鼠BMMSC的培養(yǎng)和鑒定：體外成功培養(yǎng)和擴(kuò)增出大鼠BMMSC。可從以下三個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行鑒定：① 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，傳代后的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，部分呈漩渦或菊花狀排列，具備典型的BMMSC形態(tài)特征 （圖1a）。② 細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞（油紅O染色顯示胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴，圖1b）和成骨細(xì)胞（von Kossa染色顯示細(xì)胞中出現(xiàn)黑色鈣鹽） （圖1c）。③ 細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)顯示CD29+CD34-、CD90+CD45-和 RT1A+RT1B-的陽(yáng)性率分別為99.5%、99.8%和98.5% （圖1g，h，i）。

2.1.2 重組腺病毒載體能夠成功介導(dǎo)HO-1基因到BMMSC中：用表達(dá)HO-1基因的重組腺病毒感染BMMSC，Ad-GFP作為對(duì)照。感染后48小時(shí)觀察細(xì)胞，熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)陽(yáng)性率＞80% （圖1d），免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Adv-HO-1/BMMSC組紅色標(biāo)記的HO-1表達(dá)量明顯高于單純Adv/BMMSC 組（圖 1e ～ f），HO-1基因表達(dá)明顯上調(diào)，表達(dá)量約為對(duì)照細(xì)胞的5倍。以上這些結(jié)果表明腺病毒介導(dǎo)的HO-1成功在BMMSC中過表達(dá)。HO-1轉(zhuǎn)染成功，為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

圖1 BMMSCs形態(tài)、特性、表型及轉(zhuǎn)染HO-1

2.2 大鼠小腸移植排斥反應(yīng)模型建立成功

2.2.1 一般表現(xiàn)和生存時(shí)間：BMMSC治療在一定程度上減輕了移植大鼠的急性排斥癥狀，受體大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)以及對(duì)外界刺激的反應(yīng)均有一定程度的好轉(zhuǎn)，生存率也有顯著提高，但總體效果還是不太令人滿意。HO-1/BMMSC組的觀察結(jié)果則十分令人鼓舞，在整個(gè)觀察期內(nèi)，大部分受體鼠的生存狀況良好，沒有出現(xiàn)典型的急性排斥反應(yīng)癥狀。各組的中位生存時(shí)間分別為：NS組10天、BMMSC組15天和HO-1/BMMSC組24天。HO-1/BMMSC治療進(jìn)一步提高了移植大鼠的生存率，與BMMSC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 各組移植小腸的病理表現(xiàn)（圖2）：NS組移植腸表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的急性排斥反應(yīng)。黏膜及黏膜下層逐漸加重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺窩上皮損傷及調(diào)亡小體形成，小腸絨毛破壞以及黏膜潰瘍出血。BMMSC組移植腸在5天及7天時(shí)的病理改變大大減輕，一般僅有少至中等量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及有限的腺窩上皮損傷及調(diào)亡等輕至中度的排斥反應(yīng)表現(xiàn)，而10天時(shí)雖然也相對(duì)好轉(zhuǎn)，但依然表現(xiàn)出中至重度的急性排斥反應(yīng)。HO-1/BMMSC治療組在各時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)表現(xiàn)較BMMSC組明顯改善，特別是在第10天，僅有少數(shù)發(fā)展為中度急性排斥反應(yīng)。

圖2 各組移植小腸病理表現(xiàn)（100×）

2.3 BMMSC過表達(dá)HO-1誘導(dǎo)大鼠脾臟Treg細(xì)胞高水平持久表達(dá)：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMMSC 治療顯著增加了 CD4+、CD25+、Foxp3+和Tregs的表達(dá)水平，在7天時(shí)達(dá)到峰值，10天時(shí)出現(xiàn)回落現(xiàn)象（圖3a）。HO-1/BMMSC組Tregs水平呈現(xiàn)快速穩(wěn)步上升，10天時(shí)依然保持在高水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，HO-1/BMMSC組較BMMSC組進(jìn)一步提高了Tregs表達(dá)，尤其在第10天，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3b）。

圖3 受體脾中Tregs水平

2.4 過表達(dá)HO-1增強(qiáng)BMMSC對(duì)大鼠血清中細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)（圖4）：ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HO-1/BMMSC組血清IL-10及TGF-β等與抗炎或Tregs分化相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平較對(duì)照組進(jìn)一步升高。而與促炎或Th17分化相關(guān)的細(xì)胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ上升幅度較BMMSC組顯著縮小，僅有小幅上升，IL-6、IL-17及IL-23呈現(xiàn)下降或較小幅度的波動(dòng)，而不是如BMMSC組出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，且總體水平較BMMSC組表達(dá)水平則明顯降低。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 血清中各細(xì)胞因子水平（與NS組相比，aP＜0.05；與BMMSC組相比，bP＜0.05；與HO-1/BMMSC相比，cP＜0.05）

2.5 過表達(dá)HO-1增強(qiáng)BMMSC對(duì)大鼠NK細(xì)胞活性的抑制（圖5）：BMMSC的治療雖顯著抑制了NK細(xì)胞活性，但在7天和10天時(shí)，NK細(xì)胞活性依然呈現(xiàn)較大幅度的上升趨勢(shì)， BMMSC組大致情況與此類似。HO-1/BMMSC組NK細(xì)胞活性在觀察期內(nèi)則無(wú)明顯大幅上升趨勢(shì)，僅僅是圍繞正常水平上下波動(dòng)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，NK細(xì)胞活性在HO-1/BMMSC組進(jìn)一步降低至接近正常范圍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 NK細(xì)胞活性

3 討 論

盡管隨著新型免疫抑制劑的問世和不斷發(fā)展，目前臨床小腸移植排斥反應(yīng)得到了較好的控制，但排斥反應(yīng)的發(fā)生率依然很高。有報(bào)道稱小腸移植術(shù)后的急、慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生率分別可達(dá)90%及30%～50%［14］。而長(zhǎng)期使用免疫抑制劑增加了發(fā)生高血壓、腎毒性、神經(jīng)毒性、術(shù)后腫瘤以及代謝性疾病等不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［15］。因此，尋找一種全新的不良反應(yīng)少的免疫抑制策略顯得尤為必要。

由于干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）具有低免疫原性、較低的抗原提呈能力以及獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，使其能夠在體內(nèi)及體外影響免疫系統(tǒng)，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞［16-18］，從而逃避免疫識(shí)別，抑制免疫應(yīng)答［19］。目前，MSC已經(jīng)被應(yīng)用于幾乎所有的器官移植基礎(chǔ)研究中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)移植的MSC具有歸巢的特點(diǎn)，在多種因素的作用下，外源性的或自體的MSC能夠定向趨向性遷移并定植于靶向組織［20-21］。并被證實(shí)在減輕移植免疫及誘導(dǎo)器官移植免疫耐受上發(fā)揮重要作用［22］。

MSC能夠遷移至炎癥性的結(jié)腸并發(fā)揮抗炎及調(diào)節(jié)免疫的作用［23］，但其腸道定植率極低，MSC被認(rèn)為至少是部分通過旁分泌發(fā)揮治療作用的。同時(shí)，由于局部組織的缺血、缺氧以及炎癥反應(yīng)，MSC移植后的存活率極低，移植后4天存活的細(xì)胞數(shù)量明顯下降，而只有不到1%的細(xì)胞存活超過1周［24］。無(wú)論MSC是通過何種途徑發(fā)揮其再生、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)作用的，其效應(yīng)均嚴(yán)重受限于體內(nèi)低下的生存率。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，BMMSC雖然減輕了小腸移植大鼠的急性排斥反應(yīng)，但這種效應(yīng)維持的時(shí)間較為有限，一般在7天內(nèi)效果比較顯著，而7天后便大大減弱。病理學(xué)檢測(cè)10天時(shí)，BMMSC治療組組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)亡細(xì)胞較前顯著增多，表現(xiàn)為中至重度的排斥反應(yīng)。排斥評(píng)分雖較NS組降低，但受體鼠的生存狀況及病理學(xué)改變均較前顯著加重。各種檢測(cè)結(jié)果提示，BMMSC組在抑制NK細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)水平以及誘導(dǎo)Tregs生成等方面均不能維持1周內(nèi)的良好態(tài)勢(shì)。這均與BMMSC移植體內(nèi)1周后存活率顯著降低有關(guān)。為了改善BMMSC移植體內(nèi)后的生存率，我們的研究引入了HO-1這種細(xì)胞保護(hù)性的基因。

HO-1是HO的誘導(dǎo)型，是一種細(xì)胞保護(hù)性酶，通過發(fā)揮抗炎、抗調(diào)亡、抗氧化應(yīng)激以及抗缺血/再灌注損傷等效應(yīng)而起到保護(hù)細(xì)胞的作用［25-27］。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1對(duì)各種原因引起的腸道損傷同樣具有保護(hù)及修復(fù)作用，其主要機(jī)制包括抗氧化、抗炎、抗調(diào)亡以及調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用等［28-30］。另外，HO-1對(duì)MSC具有調(diào)控作用，能夠在缺氧和氧化應(yīng)激狀態(tài)下減輕MSC的調(diào)亡［31］。然而，在器官移植的研究中，HO-1亦具有減輕排斥反應(yīng)、延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間甚至誘導(dǎo)移植物免疫耐受的作用［32-33］。本研究將HO-1通過基因工程修飾BMMSC，一方面希望借助這種具有細(xì)胞保護(hù)作用的酶能夠提高BMMSC在小腸移植大鼠體內(nèi)的存活率，另一方面希望HO-1與BMMSC兩者的免疫抑制效應(yīng)疊加，從而發(fā)揮更強(qiáng)大的免疫抑制效應(yīng)，進(jìn)而更好地控制小腸移植排斥反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小腸移植排斥反應(yīng)中，NK細(xì)胞是參與其中的效應(yīng)細(xì)胞之一，使用未處理的BMMSC治療時(shí)，NK細(xì)胞的活性雖有顯著降低，但依然呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，而使用HO-1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞治療后，NK細(xì)胞的活性被抑制在正常范圍內(nèi)，并沒有出現(xiàn)大幅度地升高，我們推測(cè)這是因?yàn)锽MMSC在體內(nèi)的存活時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)揮了更持久的免疫抑制作用，同時(shí)也可能與過表達(dá)的HO-1的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。

器官移植中移植物排斥反應(yīng)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)供體抗原的免疫反應(yīng)，Th1、Th2、Th17及Tregs 等CD4+的Th細(xì)胞分別發(fā)揮著不同的免疫效應(yīng)，Th1/Th2及Th17/Treg的比率在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［34］。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ以及TNF-α，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10以及IL-13。Th1/Th2比率及二者相關(guān)細(xì)胞因子常被用來(lái)解釋器官移植免疫相關(guān)現(xiàn)象［35］。Th17細(xì)胞的特點(diǎn)是分泌細(xì)胞因子IL-17、IL-21及IL-22［36］，其分化需要 TGF-β 和 IL-6 的參與［37］，其表型的穩(wěn)定需要 IL-23、TNF-α及IL-1β［38］。Tregs則通過分泌IL-10及TGF-β產(chǎn)生抗炎效應(yīng)及促進(jìn)自我耐受。Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-6、IL-17及IL-23可能介導(dǎo)移植排斥［39］。而Tregs則可能阻止排斥反應(yīng)的發(fā)生，甚至誘導(dǎo)并維持免疫耐受［40］。MSC的免疫調(diào)節(jié)作用與Tregs的擴(kuò)增相關(guān)，其中一些研究中MSC可以誘導(dǎo)Foxp3+和Tregs依賴性的免疫耐受［41］。本研究中，炎癥相關(guān)性細(xì)胞因子以及Th分化相關(guān)的細(xì)胞因子在BMMSC與HO-1/BMMSC治療作用下均發(fā)生顯著變化。具體來(lái)說，IL-10和TGF-β的濃度顯著升高，而 IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ濃度顯著降低。不同的是，與單純BMMSC組相比，HO-1/BMMSC組中升高IL-10、TGF-β以及降低IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ 濃度更顯著，甚至不同程度地逆轉(zhuǎn)了IL-6、IL-17和IL-23的上升趨勢(shì)。Tregs的變化也十分顯著，HO-1/BMMSC不僅進(jìn)一步上調(diào)了Tregs的表達(dá)，而且其高水平表達(dá)更為穩(wěn)定持久。我們推測(cè)以上這些效應(yīng)與HO-1保護(hù)BMMSC并增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)的作用有關(guān)。

總之，本研究中與單獨(dú)BMMSC相比，HO-1/BMMSC組對(duì)小腸移植排斥反應(yīng)的抑制作用更強(qiáng)大更持久。主要是通過抑制免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞和細(xì)胞因子發(fā)揮作用的。