三七總皂苷對動脈粥樣硬化小鼠的治療作用

任 超，王 萍，閆東明，張國麗，張建文，楊兆祥

(昆藥集團股份有限公司研發(fā)平臺，云南 昆明 650100)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是導(dǎo)致心腦血管事件發(fā)生的關(guān)鍵因素,其特點是動脈血管壁脂質(zhì)沉積、增厚、形成斑塊，造成管腔堵塞，導(dǎo)致受阻動脈遠(yuǎn)端組織、器官缺血和壞死，進(jìn)而發(fā)生心肌梗死、腦卒中等嚴(yán)重后果[1]。AS發(fā)生、發(fā)展機制十分復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為是脂質(zhì)代謝異常、內(nèi)皮損傷、炎癥、氧化應(yīng)激等因素相互作用的結(jié)果。目前，臨床用于治療AS藥物包括調(diào)節(jié)血脂、擴張血管、抗血小板黏附和聚集、溶解血栓和抗凝的藥物等，其中，他汀類藥物能夠降低血脂、減少炎癥、抑制血小板聚集與抗血栓、改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定并逆轉(zhuǎn)斑塊等，被認(rèn)為是心血管疾病重要的預(yù)防和治療藥物[2]。但是，西藥長時間服用毒副作用大、易產(chǎn)生藥物抵抗，且費用較高，而中藥能從多個靶點發(fā)揮藥理作用，且毒副作用小，在防治動脈硬化方面已逐漸得到了廣泛認(rèn)可。

三七總皂苷(total saponins of panax notoginseng, PNS)是五加科人參屬植物三七根部提取的有效活性成分, 具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)、抑制血小板聚集、增加心腦血流量的功能, 臨床廣泛用于心腦血管疾病的治療[3]。PNS治療AS的研究性報道很多，其主要通過有效抑制泡沫細(xì)胞形成、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血脂與抑制炎癥因子、粥樣斑塊穩(wěn)定作用等途徑，發(fā)揮治療AS的作用[4]。本研究通過載脂蛋白E基因敲除(ApoE-KO)小鼠AS模型，觀察了PNS對血脂的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮保護、炎癥因子的抑制、動脈斑塊的穩(wěn)定作用，證實了PNS對AS的治療作用。

1 材料

1.1實驗動物SPF級C57BL/6 ApoE-KO小鼠，♂，6周齡，購于北京維通利華實驗動物有限公司。動物許可證號: SCXK(京)-20160011。

1.2藥物與試劑PNS(9.1% R1、35.2% Rg1、32.7% Rb1、4.7% Re、7.5% Rd)，由昆藥集團股份有限公司提供，批號：SKQZ2017032；阿托伐他丁鈣(美國Sigma-Aldrich公司，批號：LRAA9204)。4%多聚甲醛(北京鼎國, 批號：AR-0211)；RNA Later RNA Stabilization Reagent(德國QIAGEN公司，批號：76106)；TUNEL試劑盒(南京凱基生物，批號：20171010)；氧化型低密度脂蛋白膽固醇(oxidized low density lipoprotein, oxLDL-C)ELISA試劑盒(美國Cloud-Clone Corp，批號：L170824945)；EasyPure RNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：ER101-01)；All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(亞太恒信生物科技北京有限公司，批號：AORT-100)；TaqManTMGene Expression Master Mix(美國Thermal Fisher公司，批號：4369016)。

1.3儀器7180生化自動分析儀(日本日立公司)；5424R離心機(德國Eppendorf公司)；CM1950冷凍切片機(德國Leica公司)；BX43顯微鏡(日本Olympus公司)；Nikon-Ni-U顯微鏡(日本Nikon公司)；7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1實驗動物分組與給藥ApoE-KO小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，檢測空腹血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)，并按照TC水平隨機分為6組(每組12只)：對照組、模型組、PNS低、中、高劑量組(50、100、200 mg·kg-1)、阿托伐他汀鈣組(20 mg·kg-1)。除對照組外，其余各組動物均給予高脂飲食喂養(yǎng)(含1.5%膽固醇、21%脂肪；美國Research Diets公司, 貨號：D12079B)，建立AS模型。8周后開始給藥，PNS用PEG400配制，阿托伐他汀鈣用生理鹽水配制，均灌胃8周。

2.2血樣采集及生化分析實驗開始第0、8、12、16周，取血檢測小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和oxLDL-C含量變化。小鼠禁食過夜后，通過下頜采血或心臟采血(終點)收集血液(150 μL) ，室溫放置2 h。4℃、7 000 r·min-1離心10 min，得到血清，檢測上述生化指標(biāo)。

2.3動脈分離及Enface檢測實驗結(jié)束時，每組取6只小鼠，通過CO2吸入進(jìn)行安樂死，并用20 mL生理鹽水通過左心室進(jìn)行灌流。心臟及主動脈(從主動脈弓到髂動脈)被完整分離。離體的動脈由主動脈弓到髂動脈縱向剖開，置于4%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)60%異丙醇同步化10 min后，置于60%油紅中染色30 min，60%異丙醇洗滌3次，每次5 min。著色的動脈用去離子水洗凈后拍照。通過Image Pro Plus 6.0軟件測量紅色斑塊區(qū)域的比例。

2.4動脈mRNA表達(dá)的檢測每組剩余6只小鼠用于細(xì)胞因子mRNA檢測。主動脈被完整分離后，浸入存有RNA later穩(wěn)定溶液的離心管中，置于4℃冰箱過夜，再移入-20℃冰箱保存,待檢測。使用Thermofisher公司TaqMan?基因表達(dá)分析系統(tǒng)，由1對未標(biāo)記的PCR引物與1條TaqMan?探針組成，見Tab 1。提取組織RNA后，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 作為模板進(jìn)行擴增。熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系(25 μL):2×Master Mix 12.5 μL，目的基因引物/探針混合物和GAPDH引物/探針混合物各1 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環(huán)45次。2-ΔΔCt法分析各組小鼠目的基因的相對表達(dá)量。

Tab 1 Information of PCR primer and probe

2.5心臟左室流出道病理評分每組取6只小鼠用于左心室流出道病理評分。小鼠心臟樣本經(jīng)甲醛溶液固定過夜后，蔗糖溶液脫水。在體視顯微鏡下用OCT進(jìn)行包埋，并制作成7 μm的冷凍切片。切片經(jīng)HE染色后，用于常規(guī)病理檢測，通過光學(xué)顯微鏡×40倍數(shù)下采集流出道圖像。同時，在顯微鏡下測量左心室流出道的斑塊區(qū)域，計算左心室流出道的斑塊比例，以反映斑塊厚度及血管狹窄。檢測標(biāo)準(zhǔn)參照人類動脈粥樣硬化疾病組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)，見Tab 2。

Tab 2 Histological classification of atherosclerosis

Type Ⅴ is divided into three sub-types: Type Va, named as thin-cap fibroatherom which has lipid core and fibrosis tissue; Type Vb, without lipid core and fibrosis tissue, but with calcification; Type Vc, without lipid core, but shows stable plaques. Type VI is divided into three sub-types: Type VIa, rupture of lesion surface; Type VIb, hemorrhage; Type VIc, thrombus.

2.6細(xì)胞凋亡的檢測心臟左心室流出道用OCT包埋并制作成冷凍切片。嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明操作，TUNEL染色結(jié)束后，滴加DAPI孵育5 min，抗熒光猝滅劑封片，采用熒光顯微鏡觀察并拍照。鏡下觀察綠色熒光為TUNEL 陽性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI對所有細(xì)胞核進(jìn)行染色。利用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件, 計數(shù)陽性細(xì)胞及區(qū)域內(nèi)總細(xì)胞, 計算陽性細(xì)胞百分比, 即為凋亡指數(shù)。

3 結(jié)果

3.1PNS對ApoE-KO小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響Tab 3結(jié)果顯示，第16周時，與對照組相比，模型組小鼠血清TC、LDL-C、HDL-C水平明顯增高，TG水平有增高的趨勢；與模型組相比， PNS(100、200 mg·kg-1)組血清TC、 TG、 LDL-C、HDL-C水平均有降低的趨勢。

3.2PNS對ApoE-KO小鼠血清oxLDL-C水平的影響oxLDL-C被認(rèn)為是AS發(fā)生的危險因素。如Fig 1所示，雖然模型組小鼠血清oxLDL-C水平與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但PNS(50、100、200 mg·kg-1)給藥后能明顯降低血清oxLDL-C水平。

Fig 1 Effects of PNS on serum content

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.3PNS對ApoE-KO小鼠AS斑塊的影響AS的病變與血栓的形成密切相關(guān)。如Fig 2所示，模型組小鼠的粥樣硬化斑塊面積占比是8.08%，明顯高于對照組(1.47%)。PNS給藥后對形成的動脈斑塊有穩(wěn)定和緩解的趨勢。

Fig 2 Effects of PNS on atherosclerotic plaqueand representative graph by oil red staining

3.4PNS對ApoE-KO小鼠左心室流出道形態(tài)學(xué)的影響對照組小鼠的左心室流出道內(nèi)膜光滑無增厚，管壁膜內(nèi)無脂質(zhì)沉淀；模型組小鼠的主動脈血管壁明顯增厚，可見斑塊和管腔狹窄；與模型組比較，PNS給藥后左心室流出道內(nèi)膜增厚和斑塊情況有一定改善(Fig 3)。

Tab 3 Effects of PNS on serum contents of TC, TG, LDL-C, HDL-C in ApoE-KO

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsmodel

Fig 3 Representative graph of left ventricular outflow tract by HE staining

A: Control; B: Model; C: Atorvastatin 20 mg·kg-1; D: PNS 50 mg·kg-1; E: PNS 100 mg·kg-1; F: PNS 200 mg·kg-1.

按照人類動脈粥樣硬化疾病組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的形態(tài)學(xué)評估顯示，各組流出道病理分型均在IV-Vb之間，除對照組外，各組之間組織學(xué)分型差異無顯著性(Tab 4)。通過表面區(qū)域測量，模型組流出道損傷面積明顯高于對照組，PNS 給藥后對流出道損傷具有一定的改善作用(Fig 4)。

3.5PNS對ApoE-KO小鼠心臟左室流出道內(nèi)皮細(xì)胞的影響心臟左室流出道內(nèi)斑塊的堆積會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞壞死、凋亡。如Fig 5所示， PNS(100、200 mg·kg-1)組明顯改善了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。

3.6PNS對ApoE-KO小鼠主動脈細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響與對照組比較，模型組細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1) mRNA表達(dá)水平有增加的趨勢，PNS給藥對ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)有降低的趨勢(Fig 6)。

Tab 4 Morphological evaluation of left ventricularoutflow tract of ApoE-KO mice(n=6)

Fig 4 Percentage of lesion area in left ventricularoutflow tract of ApoE-KO

##P<0.01vscontrol group

Fig 5 Apoptosis of endothelial cells in left ventricularoutflow tract of ApoE-KO

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 6 Effects of PNS on levels of ICAM-1 and VCAM-1mRNA in aorta of ApoE-KO

1:Control;2:Model:3:PNS 50 mg·kg-1;4:PNS 100 mg·kg-1;5:PNS 200 mg·kg-1;6:Atorvastatin 20 mg·kg-1

3.7PNS對ApoE-KO小鼠主動脈NO限速酶表達(dá)的影響與對照組比較，模型組小鼠主動脈誘導(dǎo)型NOS (inductive NOS, iNOS) mRNA表達(dá)有增加的趨勢；與模型組比較，PNS給藥組iNOS mRNA表達(dá)有降低的趨勢。與對照組比較，模型組小鼠主動脈內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS, eNOS) mRNA表達(dá)有減少的趨勢；與模型組比較，PNS給藥組eNOS mRNA表達(dá)水平有增加的趨勢，見Fig 7。

3.8PNS對ApoE-KO小鼠主動脈促炎性因子表達(dá)的影響與對照組比較，模型組小鼠主動脈IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)明顯增加，TNF-α mRNA的表達(dá)有增加的趨勢；與模型組比較，PNS給藥組IL-1β和IL-6(除PNS 100 mg·kg-1組)mRNA表達(dá)明顯降低，PNS給藥組(除PNS 200 mg·kg-1組)TNF-α mRNA表達(dá)有降低的趨勢，見Tab 5。

4 討論

Fig 7 Effects of PNS on levels of iNOS and eNOSmRNA in aorta of ApoE-KO

1:Control;2:Model:3:PNS 50 mg·kg-1;4:PNS 100 mg·kg-1;5:PNS 200 mg·kg-1;6:Atorvastatin 20 mg·kg-1

AS嚴(yán)重危害人類健康，其形成是一個十分復(fù)雜的病理生理過程, 包括脂質(zhì)代謝異常、低密度脂蛋白氧化修飾、內(nèi)皮損傷、單核細(xì)胞黏附、平滑肌細(xì)胞增生以及斑塊形成后不穩(wěn)定因素，導(dǎo)致纖維帽破裂，形成血管堵塞、瘀滯等。

高血脂被認(rèn)為是AS的始動因素，可引起血漿脂蛋白異常，導(dǎo)致動脈管壁病變。研究發(fā)現(xiàn)，LDL-C水平與AS的發(fā)生呈正相關(guān),其機制是LDL-C通過apoB100與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，沉積在動脈內(nèi)膜下，形成粥樣硬化斑塊[2]。本研究中，經(jīng)過8周高脂飲食的ApoE-KO模型組小鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C均升高，形成明顯的高脂血癥和AS；在此基礎(chǔ)上給予8周PNS，對TC、TG、LDL-C和HDL-C均有降低的趨勢，表明PNS有一定的降血脂效果。HDL-C被稱為“有益膽固醇”，它能夠轉(zhuǎn)運血液中多余的膽固醇，轉(zhuǎn)移至肝臟消化代謝。LDL-C主要負(fù)責(zé)將膽固醇轉(zhuǎn)運至血液中，所以被稱為“壞膽固醇”。大量文獻(xiàn)證實，LDL-C是心臟疾病的風(fēng)險因子，因此，HDL-C/LDL-C比例可以用來預(yù)測心臟疾病發(fā)生風(fēng)險。在實驗終點時(16周)，PNS 50 mg· kg-1給藥組的HDL/LDL比例為0.35，略微低于正常組(0.47)和阿托伐他汀鈣組(0.42)；而PNS 100、200 mg·kg-1給藥組的HDL/LDL比例分別為0.40和0.42，接近于阿托伐他汀組。因此，PNS 的降脂作用可能是其預(yù)防AS作用機制之一，并可降低心臟疾病發(fā)生的風(fēng)險。

Tab 5 Effects of PNS on levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α mRNA in aorta of ApoE-KO

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

LDL-C在代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基氧化形成oxLDL-C，oxLDL-C導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙和炎性反應(yīng)在AS的病理過程中起關(guān)鍵作用。oxLDL-C可引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)損傷，能夠降低內(nèi)皮細(xì)胞的抗纖溶活性和舒血管功能[5]。oxLDL-C還能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、PDGF-A等), 減少eNOS的產(chǎn)生，增強單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的黏附及向內(nèi)膜下移行，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成及AS斑塊的發(fā)生發(fā)展。同時，oxLDL-C可刺激多種炎癥因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等的表達(dá)，加速AS炎癥反應(yīng)[6]。雖然，在高膽固醇血癥小型豬研究中發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈斑塊的程度與斑塊內(nèi)總LDL和oxLDL-C有關(guān)，而與血液中oxLDL-C水平無關(guān)，即在循環(huán)中的oxLDL-C對AS影響不大[7]，但本研究仍發(fā)現(xiàn)，PNS可以明顯降低ApoE-KO小鼠血清oxLDL-C水平，提示PNS對血管內(nèi)皮的保護作用。

AS早期內(nèi)皮細(xì)胞釋放的VCAM-1和ICAM-1是近幾年研究的熱點，它們能促使單核細(xì)胞向動脈壁的遷移, 在AS的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠主動脈ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平有增加的趨勢，PNS給藥后小鼠主動脈ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)有降低的趨勢。提示長期灌胃PNS可降低ApoE-KO小鼠主動脈ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)，抑制AS中免疫相關(guān)細(xì)胞的黏附，從而延緩AS的進(jìn)展。

近年來研究顯示，一氧化氮(NO)在AS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，它能抑制AS過程中的許多關(guān)鍵步驟, 如血小板黏附聚集、黏附分子和趨化因子的表達(dá), 以及炎性分子的釋放、血管平滑肌的遷移和增殖等[8]。NOS是體內(nèi)產(chǎn)生NO的限速酶，eNOS和iNOS是其中的兩個亞型。eNOS在AS的發(fā)病機制方面有著雙重作用:在正常情況下,eNOS產(chǎn)生低濃度的NO, 這對機體抗AS是有益的;在高脂血癥、AS時, eNOS產(chǎn)生更少的NO,更多的超氧化物形成, 加之局部iNOS的活化, 后者產(chǎn)生的NO和過氧化物同時增加, 會導(dǎo)致AS斑塊內(nèi)高濃度、有細(xì)胞毒作用的過氧化亞硝酸鹽形成,將促進(jìn)和加速AS的發(fā)生、發(fā)展。iNOS與eNOS相比, 產(chǎn)生NO的速度更快、量更大, NO與超氧離子結(jié)合可形成過氧亞硝酸根, 能干擾細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo), 促進(jìn)AS的發(fā)生[9]。有研究顯示, iNOS主要存在于成熟AS斑塊中, 而iNOS抑制劑可延緩AS的進(jìn)程。因此, iNOS表達(dá)減弱或eNOS表達(dá)增強可抑制AS的形成和發(fā)展。本研究觀察到，PNS能糾正AS病變中iNOS表達(dá)增多和eNOS表達(dá)減少的失衡現(xiàn)象, 提示其可通過對NO途徑的調(diào)控, 具有一定的抑制炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮保護功能。同時，PNS給藥后，小鼠主動脈IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)較模型組明顯下降，TNF-α mRNA表達(dá)也有降低的趨勢，提示PNS可減輕AS過程中炎性反應(yīng)。

AS逆轉(zhuǎn)包括兩個方面：斑塊面積縮小和斑塊的穩(wěn)定性增加。AS的后期發(fā)生了許多實質(zhì)性病變，逆轉(zhuǎn)斑塊相對困難，尋找能穩(wěn)定、甚至縮小動脈斑塊的藥物對更有效治療AS十分重要[10]。本研究用電鏡觀察小鼠主動脈斑塊形成情況、左心室流出道病理形態(tài)發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠主動脈內(nèi)皮光滑完整，左心室流出道管壁無損傷，無增厚和脂質(zhì)沉淀，而模型組小鼠的主動脈有大量斑塊，左心室流出道管壁內(nèi)增厚，且有脂質(zhì)沉淀。與模型組比較，PNS給藥后小鼠主動脈斑塊面積有減少的趨勢，對流出道損傷具有一定的改善作用。

PNS作為三七的主要有效成分，對多種心血管疾病均有良好的防治作用，且安全無明顯毒副作用。近年來,三七及其有效成分治療AS的報道較多。本研究通過高脂ApoE-KO的AS小鼠模型系統(tǒng)評價了PNS對AS的治療作用，并從降低血脂、保護血管內(nèi)皮、緩解炎癥反應(yīng)、抑制免疫相關(guān)細(xì)胞的黏附等多個方面，對PNS抗AS機制進(jìn)行了分析，提示PNS能從多個環(huán)節(jié)防治AS，值得進(jìn)一步重視和開發(fā)為理想的抗AS藥物。

(致謝：本研究在昆藥集團研究院相應(yīng)生物學(xué)及動物實驗室完成，感謝黃茜、鄭曉瓊、尚建華等對實驗給予的幫助！)