淫羊藿次苷Ⅱ通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表達(dá)抗自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化

付 舒，李葉麗，吳雨婷，岳 云，高 楊，楊丹莉

(基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003)

心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF) 主要表現(xiàn)為心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過度沉積，以膠原成分比例失調(diào)，且排列紊亂為主要特征的疾病。MF可導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙[1]。許多報道顯示，心臟纖維化是不同病理情況下心功能不全發(fā)生的重要原因[2-4]，最終導(dǎo)致心臟衰竭致心臟功能喪失[5]。研究表明，ECM合成或降解失衡是導(dǎo)致MF的重要環(huán)節(jié)，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)相互作用是調(diào)節(jié)ECM動態(tài)平衡的關(guān)鍵[6]。淫羊藿次苷Ⅱ(icarisid Ⅱ，ICS Ⅱ)是從中藥淫羊藿中提取的一種多羥基黃酮類單體，是淫羊藿中的主要成分之一，具有抗炎、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、改善心肌細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)和藥理學(xué)作用[7-8]。本研究旨在觀察Ics Ⅱ是否具有抗自發(fā)性大鼠MF的作用，以及該效應(yīng)是否與其影響MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組以13周齡的♂自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)大鼠20只作為研究對象，以同齡♂WKY大鼠5只為陰性對照組，體質(zhì)量280～320 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001，SPF級。將SHR大鼠隨機分為ICS Ⅱ低劑量組(4 mg·kg-1, ICS Ⅱ-L)、中劑量組(8 mg·kg-1, ICS Ⅱ-M)、高劑量組(16 mg·kg-1, ICS Ⅱ-H)和模型組(SHR組)。ICS Ⅱ-L、ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組持續(xù)灌胃12周，WKY組、SHR組分別給予等體積雙蒸水。ICS Ⅱ溶解于雙蒸水中，每次大鼠灌胃給藥前，超聲10 min，制成混懸液。

Tab 1 Sequences of primers used for real time polymerase chain reaction

1.2藥品、試劑與儀器ICS Ⅱ，純度≥98%，購于南京澤朗醫(yī)藥有限公司；Masson三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；GAPDH、MMP-2、MMP-9、TIMP-1引物購自生工生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa生物工程公司；RNA熒光混合物購自美國Bio-Rad公司；MMP-2兔抗大鼠抗體購自生工生物工程有限公司；GAPDH、MMP-9、TIMP-1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ兔抗大鼠抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光劑購于七海生物有限公司。5417R離心機、RNA逆轉(zhuǎn)錄儀(德國Eppendorf公司)；Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、Mini-PROTEAN3電泳儀、CCD成像系統(tǒng)、real time RT-PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)；光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本 Olympus公司)。

1.3大鼠尾部血壓的測量采用Kent Scientific CODA鼠尾無創(chuàng)血壓計測量清醒、安靜狀態(tài)下大鼠尾部動脈收縮壓。

1.4大鼠左心質(zhì)量指數(shù)的計算給藥至26周后，2%戊巴比妥(2 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，取出各組大鼠心臟組織，分離左心室，計算左心質(zhì)量指數(shù)。左心質(zhì)量指數(shù)=左心重量(g) /大鼠體重(g)×100。

1.5大鼠心臟組織病理學(xué)檢查取大鼠左心室組織，浸入4%中性甲醛溶液中固定48 h后，石蠟包埋、切片，Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌膠原含量變化。

1.6RealtimePCR法檢測左心室組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平參照Gen-Bank 基因庫中關(guān)于大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA序列設(shè)計引物，引物序列見Tab 1。取各組心臟組織100 mg，置于1 mL TRIzol中提取總RNA并純化。目的基因表達(dá)用相對定量法，以PCR擴增過程中熒光信號強度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，Ct值的平均值=(Ctl+Ct2)/2(重復(fù)管)；dCt=Ct值的平均值-中間值(相同檢測基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值)；基因的轉(zhuǎn)錄水平=2-dCt；相對定量=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)×100，將WKY組的mRNA表達(dá)設(shè)為100。

1.7Westernblot檢測左心室組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的表達(dá)取大鼠心臟組織約200 mg，剪碎后，放入1 mL RIPA裂解液中，加入蛋白磷酸酶抑制劑10 μL及PMSF 10 μL，混勻，冰上勻漿后靜置，離心，取上清液，BCA法測定待測樣品的總蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜，5%蛋白封閉液室溫封閉2 h后，TBST洗膜。一抗GAPDH (1 ∶5 000)、MMP-2 (1 ∶500)、MMP-9 (1 ∶500)、TIMP-1 (1 ∶500)、Collagen Ⅰ (1 ∶1 000)、Collagen Ⅲ (1 ∶1 000) 4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG (1 ∶5 000)、山羊抗小鼠IgG (1 ∶5 000)常溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色，采用CCD成像系統(tǒng)獲取圖像。

2 結(jié)果

2.1ICSⅡ?qū)HR大鼠收縮壓的影響與WKY組相比，26周齡SHR組大鼠收縮壓明顯上升(P<0.05)，是WKY組的1.54倍；與SHR組相比，給予ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H后收縮壓分別下降了10.32%、15.30%(P<0.05)，見Fig 1。

2.2ICSⅡ?qū)HR大鼠左心質(zhì)量指數(shù)的影響如Fig 2所示，與WKY組相比，SHR組大鼠左心質(zhì)量指數(shù)明顯增加(P<0.05)；給予ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H可降低左心質(zhì)量指數(shù)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3大鼠左心室膠原纖維沉積情況Fig 3的Mas- son染色結(jié)果顯示，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。WKY組心肌肌束間有較少膠原沉積。與WKY組相比，SHR組心肌肌束間隙不同程度增大，心肌細(xì)胞間質(zhì)可見明顯纖維化改變，伴有嚴(yán)重的膠原沉積。與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組心肌細(xì)胞纖維化程度明顯減輕。說明ICS Ⅱ?qū)HR 心肌纖維化及其膠原沉積有一定的改善作用。

Fig 1 Effect of ICS Ⅱ on systolic

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

Fig 2 Effects of ICS Ⅱ on left ventricular

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

2.4ICSⅡ?qū)HR大鼠左心室CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)的影響Fig 4的Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。

2.5ICSⅡ?qū)HR大鼠左心室MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA表達(dá)的影響如Fig 5所示，與WKY組比較，模型組SHR大鼠左心室MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05)，TIMP-1 mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與SHR組比較，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)明顯下降，TIMP-1 mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

Fig3LeftventricularcollagendepositioninSHRs(×400)

A: WKY; B: SHR; C: ICS Ⅱ-L; D: ICS Ⅱ-M; E: ICS Ⅱ-H.

Fig 4 Effect of ICS Ⅱ administration on protein expressionof Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲ in left ventricle of

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

2.6ICSⅡ?qū)HR大鼠左心室MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響Fig 6的Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，TIMP-1的蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯下降，TIMP-1的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

Fig 5 Effects of ICS Ⅱ on mRNA expressionof MMP-2, MMP-9,TIMP-1in left ventricle of

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

Fig 6 Effect of ICS Ⅱ administrationon protein expression of MMP-2,MMP-9, TIMP-1 in left ventricle of

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

3 討論

SHR大鼠是一種與人類慢性高血壓接近的動物模型。有研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠在20周齡時心肌纖維增多，心肌間質(zhì)內(nèi)可見大量膠原聚集，心肌膠原面積的比例明顯增高[9]。本研究中，14 周齡♂SHR大鼠喂養(yǎng)至26周齡，SHR組收縮壓、左心質(zhì)量指數(shù)明顯升高，病理學(xué)Masson染色結(jié)果顯示，SHR組心肌肌束間隙不同程度增大，心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管周圍可見明顯纖維化改變，并伴有嚴(yán)重的膠原沉積，表明26周齡的SHR已發(fā)生明顯的MF，這與本課題組前期研究一致[10]。給予ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H后，SHR組收縮壓、左心質(zhì)量指數(shù)下降，MF程度明顯改善。

Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維蛋白是心臟ECM的主要成分[11]，MMPs是降解ECM成分的主要酶系，在心血管系統(tǒng)的重構(gòu)過程中，通過影響ECM的降解，在高血壓血管病變的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[12]。MMPs跟據(jù)作用底物的不同分為 5大類，而明膠酶MMP-2和MMP-9與心血管疾病密切相關(guān)[13-14]。在心肌組織中，MMP-2和MMP-9已經(jīng)被證明是ECM的主要調(diào)節(jié)因子，它們對變性的纖維膠原蛋白具有底物親和力[15]。研究表明，心肌梗死后，MMPs特別是MMP-2上調(diào)，引起MMPs和TIMPs在心臟組織中的比例失衡，導(dǎo)致心臟ECM的降解，心肌組織厚度減小(心室壁變薄)，最終導(dǎo)致心功能的惡化[15-16]。本研究結(jié)果顯示，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室MMP-9、MMP-2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達(dá)明顯增加，TIMP-1的表達(dá)明顯降低，MMP-9/TIMP-1比值增大，導(dǎo)致 MMPs/TIMPs失衡，促進(jìn)MF的發(fā)展；與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室中MMP-9、MMP-2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達(dá)明顯下調(diào)，TIMP-1的表達(dá)明顯上調(diào)，MMP-9/TIMP-1比值降低。表明給予ICS Ⅱ干預(yù)后，SHR心肌MMPs/TIMPs 的失調(diào)得到明顯改善，提示ICS Ⅱ 可能通過抑制MMP-9、MMP-2的表達(dá)，促進(jìn)TIMP-1表達(dá)，改善MMPs/TIMPs 的失調(diào)，調(diào)控膠原的合成與降解，減輕SHR大鼠的MF。

綜上，ICS Ⅱ具有抗SHR大鼠MF的作用，其機制可能與降低血壓，上調(diào)MMP-9、MMP-2，下調(diào)TIMP-1的表達(dá)，改善MMPs/TIMPs的失調(diào)有關(guān)。