溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡和免疫相關(guān)基因的影響

盧芷程 許鑾佳 盧文宇 譚翠婷 陳勁鑫 郭慧

摘要：【目的】明確溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性影響及應(yīng)激情況下對(duì)蝦的生理響應(yīng)，為揭示凡納濱對(duì)蝦的免疫機(jī)理提供參考依據(jù)。【方法】采用微量注射器于凡納濱對(duì)蝦第二、三步足間注射10.0 μL溶藻弧菌懸液（1×108 CFU/mL），對(duì)照組注射等量滅菌生理鹽水，分別于感染后0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 h取樣，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定對(duì)蝦血細(xì)胞中的活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）含量，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析溶藻弧菌感染對(duì)血細(xì)胞過氧化氫酶基因（CAT）、QM基因、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因（TGase）、細(xì)胞色素C基因（CYC）和Caspase-3基因表達(dá)的影響。【結(jié)果】凡納濱對(duì)蝦感染溶藻弧菌后，其血細(xì)胞中ROS和NO含量均隨感染時(shí)間的延長呈持續(xù)上升趨勢(shì);CAT基因的相對(duì)表達(dá)量在感染后6.0 h極顯著升高至峰值（P<0.01，下同），隨后持續(xù)下降，至感染后48.0 h極顯著低于對(duì)照組;QM基因的相對(duì)表達(dá)量呈先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)，于感染后12.0 h達(dá)峰值，而后持續(xù)下降，至感染后48.0 h其相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組;TGase基因的相對(duì)表達(dá)量分別在感染后1.5和12.0 h出現(xiàn)峰值，從出現(xiàn)第2個(gè)峰值后開始快速下降，至感染后48.0 h其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05，下同）;CYC基因相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，于感染后1.5 h達(dá)峰值，隨后持續(xù)下降，從感染后12.0 h起低于對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）;Caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量在感染后1.5 h達(dá)峰值，至感染后6.0 h其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，隨后逐漸恢復(fù)，于感染后24.0 h出現(xiàn)第2個(gè)峰值，但至感染后48.0 h又降至正常水平以下。【結(jié)論】溶藻弧菌感染初期凡納濱對(duì)蝦啟動(dòng)免疫機(jī)制并產(chǎn)生ROS和NO以對(duì)抗病原菌入侵，隨感染時(shí)間的延長，機(jī)體內(nèi)積累過多ROS和NO，此時(shí)抗氧化系統(tǒng)被激活;當(dāng)過多的ROS和NO無法被抗氧化系統(tǒng)清除時(shí)，CYC和Caspase-3等凋亡相關(guān)基因大量表達(dá)以清除受損細(xì)胞。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對(duì)蝦;溶藻弧菌;基因差異表達(dá);免疫指標(biāo);細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)： S945.49? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）12-2559-07

Effects of Vibrio alginolyticus on hemocytes toxicity， apoptosis and immune-related genes in Litopenaeus vannamei

LU Zhi-cheng， XU Luan-jia， LU Wen-yu， TAN Cui-ting， CHEN Jin-xin， GUO Hui*

（College of Fisheries， Guangdong Ocean University/Guangdong Research Center on Reproductive Control and Breeding Technology of Indigenous Valuable Fish Species/Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang， Zhanjiang， Guangdong? 524025， China ）

Abstract：【Objective】The toxic effect of Vibrio alginolyticus on Litopenaeus vannamei and the physiological response of L. vannamei under stress were explored in order to provide referential? basis for revealing the immune mechanism of L. vannamei. 【Method】10.0 μL V. alginolyticus suspension（1×108 CFU/mL ） were injected in the intermediate section between the second and third feet of L. vannamei with micro injector. Equal volume of sterilized saline was injected in the control group. Hemocytes were sampled at 0， 1.5， 3.0， 6.0， 12.0， 24.0 and 48.0 h after infection. The contents of reactive oxygen species（ROS） and nitric oxide（NO） in hemocytes of L. vannamei were determined by flow cytometry. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the effect of V. alginolyticus infection on the relative gene expression levels of catalase gene（CAT）， QM gene， transglutaminase gene（TGase）， cytochrome C gene（CYC） and Caspase-3 gene. 【Result】The results revealed that with the extension of infection time， the contents of ROS and NO in hemocytes of L. vannamei after V. alginolyticus infection both kept a rising trend， the relative expression level of CAT gene extremely increased and reached the peak at 6 h after infection（P<0.01， the same below）， then decreased continuously and was extremely lower than that in control group at 48.0 h after infection.The relative expression level of QM gene decreased first， and then increased and decreased again， it reached the peak at 12.0 h after infection， then decreased continuously. At 48 h after infection， the relative expression level of QM gene was extremely lower than that in control group. The relative expression level of TGase gene reached the peaks at 1.5 h and 12.0 h， then reduced rapidly after the second peak. At 48.0 h after infection， the relative expression level of TGase gene was significantly lower than that in control group（P<0.05， the same below）. The relative expression level of CYC gene increased first and then decreased， and reach the peak at 1.5 h after infection， and then decreased continuously. At 12.0 h after infection， the relative expression level of CYC gene was lower than that in control group， but the difference was not significant（P>0.05）. The relative expression level of Caspase-3 gene reached the peak at 1.5 h after infection. At 6.0 h after infection， the relative expression level of Caspase-3 gene was significantly lower than that in control group， then gradually returned to normal level. At 24.0 h after infection， the relative expression level of Caspase-3 gene reached the second peak， and then decreased to below the normal level 48.0 h after infection. 【Conclusion】These results indicate that at the initial stage after V. alginolyticus infection， the immune mechanism of L. vannamei is activated and the production of ROS and NO are induced to fight against the invasion of pathogenic bacteria. As the extension of infection time， the excessive ROS and NO are accumulated in organism， and the antioxidant system is activated to eliminate ROS and NO. However， when the production of ROS and NO are too excessive to be removed timely by antioxidant system， then high expressions of apoptosis-related genes such as CYC and Caspase-3 are induced to eliminate damaged cells.

Key words： Litopenaeus vannamei; Vibrio alginolyticus;? gene differential expression; immune index; apoptosis

0 引言

【研究意義】凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）作為我國養(yǎng)殖規(guī)模最大的對(duì)蝦品種，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要的經(jīng)濟(jì)地位，但高密度養(yǎng)殖模式下各類病害的暴發(fā)嚴(yán)重制約了凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖效益的提高及其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展（黃旭雄等，2014）。溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海洋環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌種之一，也是一種常見的條件致病菌，在水溫25～35 ℃的條件下極易引起水生動(dòng)物暴發(fā)流行弧菌病，已對(duì)我國南方地區(qū)的海水養(yǎng)殖造成重大影響（胡學(xué)峰等，2005;陳強(qiáng)等，2006;梅冰等，2015）。據(jù)水產(chǎn)病害監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，弧菌病已成為海水養(yǎng)殖中最常見、流行廣、危害大的一類疾?。ê鷫?mèng)華，2015）。因此，研究溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞毒性及其免疫相關(guān)基因的影響，對(duì)揭示凡納濱對(duì)蝦自身免疫機(jī)理和保障其產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】溶藻弧菌的侵襲會(huì)對(duì)宿主生物體的組織造成傷害，擾亂機(jī)體的正常代謝功能（梅冰等，2015）。曹劍香等（2004）通過研究溶藻弧菌疫苗對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS）有增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用，但過量積累會(huì)致使生物膜脂過氧化，從而引起功能障礙甚至壞死;劉文珍和邱德全（2007）研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮（NO）系統(tǒng)對(duì)凡納濱對(duì)蝦感染溶藻弧菌有清除作用，但過量的NO會(huì)對(duì)蝦體產(chǎn)生不利影響;Kong等（2018b）研究發(fā)現(xiàn)，在弧菌感染條件下PI3K基因沉默凡納濱對(duì)蝦個(gè)體中的ROS含量更高，表明ROS在弧菌感染應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。此外，溶藻弧菌感染對(duì)機(jī)體免疫和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)也有一定影響。羅詞興等（2014）研究表明，注射溶藻弧菌會(huì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的鰓組織產(chǎn)生一定影響，表現(xiàn)為鰓組織中免疫相關(guān)基因和抗氧化酶的表達(dá)發(fā)生明顯變化;Xie等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌感染可有效誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)基因PTEN的表達(dá)，故推測(cè)其在PI3K/AKT信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用;Gu等（2017）研究分析凡納濱對(duì)蝦感染溶藻弧菌后其免疫和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHB2基因在細(xì)胞氧化和細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，而Prohibitin2基因在弧菌感染的應(yīng)答中發(fā)揮重要作用;Kong等（2018a）研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦凋亡相關(guān)基因Cdc42基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)以響應(yīng)溶藻弧菌的感染。【本研究切入點(diǎn)】前人的研究?jī)H從酶活性、免疫或凋亡相關(guān)基因等單方面揭示凡納濱對(duì)蝦應(yīng)激條件下的生理生化反應(yīng)，而鮮見從細(xì)胞或分子水平綜合免疫及凋亡相關(guān)基因探索溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞影響的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用流式細(xì)胞儀測(cè)定溶藻弧菌感染凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中的ROS和NO含量，并從分子角度分析溶藻弧菌感染對(duì)過氧化氫酶基因（CAT）、QM基因、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因（TGase）、細(xì)胞色素C基因（CYC）和半胱氨酸蛋白酶-3基因（Caspase-3）表達(dá)的影響，明確溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性影響條件及應(yīng)激條件下對(duì)蝦的生理響應(yīng)，為揭示凡納濱對(duì)蝦的免疫機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦購自廣東湛江市東海島某養(yǎng)殖場(chǎng)，選取大小均勻（體長8～10 cm）、活力好、體色健康、體表無損傷的個(gè)體。溶藻弧菌由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1. 2 感染試驗(yàn)

試驗(yàn)前1周對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行曝氣。凡納濱對(duì)蝦于循環(huán)水中暫養(yǎng)2周，每天投喂2次，排污1次，定時(shí)清理養(yǎng)殖系統(tǒng)，試驗(yàn)前1 d停止投餌。本研究共設(shè)7個(gè)注射組，每組15尾對(duì)蝦，設(shè)3個(gè)平行，采用微量注射器于對(duì)蝦第二、三步足間注射10.0 μL溶藻弧菌懸液（1×108 CFU/mL）;對(duì)照組注射等量滅菌生理鹽水。試驗(yàn)對(duì)蝦均暫養(yǎng)于120 L的塑料桶中，感染期間持續(xù)充氧，停止投餌。分別于感染后0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 h觀察對(duì)蝦的生理反應(yīng)，記錄死亡時(shí)間和死亡數(shù)量，統(tǒng)計(jì)各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)蝦致死率。同時(shí)每組隨機(jī)抽取9尾對(duì)蝦，用注射器先抽取0.2 mL抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8.0 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH 7.5），然后按1∶1的比例在蝦體圍心腔處抽取其血淋巴（冼健安等，2016）。以200.0 μL預(yù)冷的抗凝劑將對(duì)蝦血細(xì)胞稀釋至1×106個(gè)/mL左右，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。余下的對(duì)蝦血淋巴離心后以Trizol進(jìn)行懸浮，-80 ℃保存，用于基因表達(dá)分析。

1. 3 血細(xì)胞指標(biāo)測(cè)定

1. 3. 1 流式細(xì)胞儀分析 利用美國Becton Dickin-son公司的FACSVerse流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，根據(jù)郭慧等（2017a）的方法獲取熒光數(shù)據(jù)，然后采用Cell Quest（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA）進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。

1. 3. 2 血細(xì)胞ROS和NO含量測(cè)定 參照郭慧等（2017a）的方法，以DCFH-DA為探針檢測(cè)ROS含量、以DAF-FM為探針檢測(cè)NO含量，然后以DCF熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、感染時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制單參數(shù)直方圖。

1. 4 基因差異表達(dá)

按照Trizol試劑盒（TaKaRa公司）說明進(jìn)行血細(xì)胞總RNA提取，然后采用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆茫ü鄣龋?017b，2017c）。參照美國國家生物技術(shù)信息中心（National center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中的參考序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物（表1）。按SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa公司）說明，用Bio-Rad Real-time CFX96進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，具體程序：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt計(jì)算CAT、CYC、QM、Caspase-3和TGase基因的相對(duì)表達(dá)量。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0中的配對(duì)t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析同一時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 溶藻弧菌感染對(duì)凡納濱對(duì)蝦致死率的影響

溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致死率如圖1所示。在感染后1.5 h對(duì)蝦開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，在整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)蝦致死率隨感染時(shí)間的延長而逐漸增加，至感染后48.0 h達(dá)最大值。

2. 2 血細(xì)胞毒性指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2. 2. 1 ROS含量的變化 由圖2可看出，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中ROS含量在感染后6.0 h內(nèi)無顯著變化（P>0.05，下同），從感染后12.0 h起快速升高，ROS含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05，下同），至感染后24.0和48.0 h均極顯著高于對(duì)照組（P<0.01，下同）。可見，溶藻弧菌感染能刺激凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中ROS含量的增加，且隨感染時(shí)間的延長，其含量增加趨勢(shì)越明顯，于感染后48.0 h達(dá)峰值。

2. 2. 2 NO含量的變化 溶藻弧菌感染對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中NO含量的影響如圖3所示。凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中NO含量在感染溶藻弧菌后呈持續(xù)上升趨勢(shì)，從感染后12.0 h起快速升高，于感染后24.0 h達(dá)峰值，且極顯著高于對(duì)照組。

2. 3 溶藻弧菌感染對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫和凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況

2. 3. 1 CAT基因相對(duì)表達(dá)量的變化 溶藻弧菌感染后3.0 h內(nèi)，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞CAT基因的相對(duì)表達(dá)量無顯著變化，至感染后6.0 h其相對(duì)表達(dá)量極顯著升高至峰值;感染后12.0 h CAT基因的相對(duì)表達(dá)量呈明顯下降趨勢(shì)，但仍顯著高于對(duì)照組;而后持續(xù)下降，至感染后24.0 h表現(xiàn)為顯著低于對(duì)照組，感染后48.0 h則極顯著低于對(duì)照組（圖4）。

2. 3. 2 QM基因相對(duì)表達(dá)量的變化 由圖5可看出，凡納濱對(duì)蝦感染溶藻弧菌后其血細(xì)胞QM基因的相對(duì)表達(dá)量呈先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)。在感染后1.5～3.0 h，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞QM基因的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組呈極顯著下降趨勢(shì);但感染后6.0 h其相對(duì)表達(dá)量快速上升，至感染后12.0 h其相對(duì)表達(dá)量達(dá)峰值，極顯著高于對(duì)照組;而后持續(xù)下降，至感染后48.0 h其相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組。

2. 3. 3 TGase基因相對(duì)表達(dá)量的變化 由圖6可看出，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞TGase基因相對(duì)表達(dá)量在溶藻弧菌感染后1.5 h極顯著高于對(duì)照組，但感染后3.0～6.0 h其相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)至正常水平;至感染后12.0 h再次極顯著上升并達(dá)峰值，隨后開始快速下降，至感染后48.0 h其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。

2. 3. 4 CYC基因相對(duì)表達(dá)量的變化 凡納濱對(duì)蝦感染溶藻弧菌后其血細(xì)胞CYC基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖7）。感染后1.5 h凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞CYC基因相對(duì)表達(dá)量迅速升高至峰值，極顯著高于對(duì)照組;隨后開始下降，至感染后3.0 h其相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組，從感染后12.0 h起CYC基因相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，但差異不顯著。

2. 3. 5 Caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量的變化 如圖8所示凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞Caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量在溶藻弧菌感染后1.5 h達(dá)峰值，極顯著高于對(duì)照組，感染后3.0 h迅速下降，但仍極顯著高于對(duì)照組;至感染后6.0 h其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，隨后逐漸恢復(fù)，至感染后24.0 h出現(xiàn)第2個(gè)峰值，極顯著高于對(duì)照組，但在感染后48.0 h又降至正常水平以下。

3 討論

3. 1 溶藻弧菌感染對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞毒性的影響

ROS是機(jī)體正常新陳代謝的產(chǎn)物，具有增強(qiáng)免疫、抑制細(xì)菌及殺死惡性細(xì)胞等作用;但ROS的積累會(huì)促使生物膜脂過氧化，從而損壞細(xì)胞膜通透性，引起功能障礙甚至壞死（曹劍香等，2004）。已有相關(guān)研究表明，在2，2'，4，4'-四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）誘導(dǎo)斑馬魚胚胎或幼魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激的過程中，ROS是誘發(fā)胚胎發(fā)生DNA損傷的導(dǎo)火索（趙雪松等，2015）;亞硝酸鹽中毒后羅氏沼蝦會(huì)產(chǎn)生過量ROS，從而導(dǎo)致血細(xì)胞凋亡（冼健安等，2016）。本研究結(jié)果表明，溶藻弧菌感染凡納濱對(duì)蝦后其血細(xì)胞中的ROS含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，從感染后24.0 h起極顯著高于對(duì)照組，說明溶藻弧菌感染導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞大量積累ROS。NO是水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)正常生理生化反應(yīng)的產(chǎn)物，其生成依賴于一氧化氮合酶（NOS）。正常情況下，NO參與機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)功能，還能通過與超氧自由基（ ）反應(yīng)形成過氧亞硝酸鹽陰離子（ONOO-），而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用（盧秀紅等，2009）。劉文珍和邱德全（2007）研究發(fā)現(xiàn)，NO系統(tǒng)對(duì)溶藻弧菌具有清除作用。本研究結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦感染溶藻弧菌后其血細(xì)胞中NO含量也呈持續(xù)上升趨勢(shì)，即溶藻弧菌的入侵會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生大量NO。

3. 2 溶藻弧菌感染對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

CAT是一種重要的抗氧化酶，其主要作用是清除機(jī)體代謝積累的H2O2。任海等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在低鹽或高鹽脅迫下脊尾白蝦CAT基因均顯著高于對(duì)照組，表明外界感染會(huì)影響CAT的轉(zhuǎn)錄水平。本研究結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞CAT基因的相對(duì)表達(dá)量在溶藻弧菌感染后6.0～12.0 h呈上調(diào)表達(dá)，顯著或極顯著高于對(duì)照組，即溶藻弧菌感染可誘導(dǎo)CAT基因表達(dá)，產(chǎn)生大量CAT以清除機(jī)體積累的H2O2;但感染后24.0～48.0 h，CAT基因的相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，究其原因可能是溶藻弧菌大量繁殖造成機(jī)體損傷或抑制CAT活性，導(dǎo)致H2O2大量積累而使細(xì)胞受損。

在真核生物中，QM作為一種核糖體蛋白參與到核糖體組裝及蛋白質(zhì)合成的過程中，在機(jī)體基本生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。劉勇杰（2014）研究表明，QM基因在機(jī)體免疫應(yīng)答方面起關(guān)鍵作用，日本囊對(duì)蝦QM基因在感染白斑病毒（WSSV）后顯著上調(diào)表達(dá)，且與血藍(lán)蛋白結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)榉友趸?，從而介?dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有大量溶藻弧菌注入凡納濱對(duì)蝦后可導(dǎo)致蝦體細(xì)胞凋亡，但隨后立即啟動(dòng)其自身免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因表達(dá)以對(duì)抗病原菌，故QM基因相對(duì)表達(dá)量顯著上升;感染后24.0～48.0 h凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞QM基因的相對(duì)表達(dá)量又迅速下降，可能與溶藻弧菌大量繁殖導(dǎo)致機(jī)體免疫功能損傷有關(guān)。

TGase在生物體內(nèi)參與重要的生理生化過程，如蛋白交聯(lián)及凝血作用等。此外，TGase在無脊椎動(dòng)物的保守防御機(jī)制中扮演重要角色。Fagutao等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，TGase基因沉默可導(dǎo)致對(duì)蝦Crustin和溶解酵素的表達(dá)量下降，TGase基因缺失對(duì)蝦體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)明顯少于正常蝦體，說明TGase是對(duì)蝦免疫應(yīng)答的重要組成部分，涉及免疫相關(guān)基因尤其是抗菌多肽類基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞TGase基因的相對(duì)表達(dá)量在溶藻弧菌感染后1.5 h極顯著高于對(duì)照組，感染后3.0～6.0 h恢復(fù)至正常水平，感染后12.0 h再次極顯著上升并達(dá)峰值，隨后開始快速下降，至感染后48.0 h其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，說明溶藻弧菌能誘導(dǎo)TGase基因大量表達(dá)以對(duì)抗侵害，但后期由于對(duì)蝦免疫系統(tǒng)遭受破壞，因此TGase基因表達(dá)量快速降低。

3. 3 溶藻弧菌感染對(duì)凡納濱對(duì)蝦凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

CYC是線粒體中參與三磷酸腺苷（ATP）合成的關(guān)鍵酶之一。受信號(hào)刺激后細(xì)胞通透性轉(zhuǎn)換使其釋放出線粒體，通過與其他因子結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，激活下游Caspase-9和Caspase-3通路，促使細(xì)胞凋亡。Hu和Yao（2016）研究分析白斑綜合癥病毒（WSSV）感染凡納濱對(duì)蝦后其肝胰腺AIF和CYC基因的表達(dá)量情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并推測(cè)其在對(duì)蝦血淋巴中同樣發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞CYC基因的相對(duì)表達(dá)量在溶藻弧菌感染后1.5 h迅速升高至峰值，隨后逐漸恢復(fù)至正常水平，推測(cè)溶藻弧菌可誘導(dǎo)CYC基因大量轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase-3處于半胱氨酸蛋白酶（Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，通過降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物而促使細(xì)胞死亡;其他的下游Caspase成員則可能是細(xì)胞凋亡的真正執(zhí)行者（張曉田和宋天佑，2002）。本研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞Caspase-3基因的相對(duì)表達(dá)量在溶藻弧菌感染后1.5～3.0 h極顯著高于對(duì)照組，說明溶藻弧菌的侵入激活了細(xì)胞凋亡途徑并誘導(dǎo)Caspase-3基因大量表達(dá);感染后6.0 h下降至最低值，但至感染后24.0 h出現(xiàn)第2個(gè)峰值，可能是由于對(duì)蝦免疫系統(tǒng)中抗氧化相關(guān)酶的大量表達(dá)再次刺激Caspase-3基因表達(dá)量快速上升;最后因免疫系統(tǒng)受損，Caspase-3基因表達(dá)量降至正常水平以下，與Jiang等（2015）的研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

溶藻弧菌感染初期凡納濱對(duì)蝦啟動(dòng)免疫機(jī)制并產(chǎn)生ROS和NO以對(duì)抗病原菌入侵，隨感染時(shí)間的延長，機(jī)體內(nèi)積累過多ROS和NO，此時(shí)抗氧化系統(tǒng)被激活;當(dāng)過多的ROS和NO無法被抗氧化系統(tǒng)清除時(shí)，CYC和Caspase-3等凋亡相關(guān)基因大量表達(dá)以清除受損細(xì)胞。

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