叉頭框D3蛋白在胃癌組織中的表達及臨床意義

唐思鋒，張升波，王鋒，李濤

濟南市人民醫(yī)院胃腸外科，濟南 271100

研究表明，70%的胃癌發(fā)生于發(fā)展中國家，其中男性與女性胃癌的發(fā)病比例為2∶1[1]。在中國，胃癌的發(fā)病率居所有腫瘤的第2位，病死率居所有腫瘤的第3位，嚴重威脅著人們的生命安全[2]。經(jīng)手術(shù)、放化療等抗腫瘤治療后，早期胃癌患者的5年生存率明顯提高；但是，由于多數(shù)胃癌患者確診時已處于中晚期，錯失了最佳的治療時期，因而預(yù)后較差[3]。因此，尋求一種有效的早期胃癌診斷方案成為目前臨床研究的熱點。叉頭框D3蛋白（forkhead box D3，F(xiàn)OXD3）是叉頭框蛋白家族成員之一，屬于干細胞多功能因子，可以參與調(diào)控胚胎發(fā)育、糖類代謝、脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)控及生物老化等多個過程；同時，其還與上皮性卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。本研究對胃癌患者胃癌組織中FOXD3的表達水平及與患者臨床特征的關(guān)系進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年6月至2018年6月濟南市人民醫(yī)院收治的118例胃癌患者。納入標準：①符合《中國臨床腫瘤學會（CSCO）原發(fā)性胃癌診療指南》[5]中相關(guān)標準；②經(jīng)超聲胃鏡及手術(shù)后病理學檢查確診為胃腺癌；③獲取胃癌組織標本前，無放化療史及幽門螺桿菌治療史；④病歷資料完整。排除標準：①患有免疫系統(tǒng)疾病者；②患有類風濕性疾病者；③復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃癌。118例胃癌患者中，男67例，女51例；年齡42～77歲，平均（56.8±10.2歲）；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期49例，Ⅲ期37例，Ⅳ期10例；病灶直徑：≥3.0 cm 75例，＜3.0 cm 43例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例；組織學分化程度：高分化32例，中分化43例，低分化43例。收集胃癌患者的胃癌組織標本及對應(yīng)的癌旁組織標本各118例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組化染色法檢測FOXD3蛋白表達

取胃癌組織和癌旁組織標本進行切片，脫蠟、水化處理后，于高溫高壓環(huán)境下選用枸櫞酸鹽修復(fù)液進行抗原修復(fù)操作，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次；采用3 ml 3%H2O2清除過氧化酶活性，反應(yīng)10 min，PBS洗滌2次；50 μl 3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液孵化15 min，加入鼠抗人FOXD3單克隆抗體（濃度1∶2000），室溫下過夜，PBS洗滌2次；加入羊抗兔二抗，孵育30 min，PBS洗滌2次；隨后選用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑進行3 min顯色操作，并選用蘇木素復(fù)染30 s，乙醇脫水，透明封片，鏡檢。

1.3 免疫組化染色法評定標準

免疫組化染色法評定標準：FOXD3蛋白染色見于細胞核內(nèi)，該蛋白陽性染色呈黃色、棕黃色、褐色。根據(jù)染色程度進行評分：0分，未著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，褐色或黑色。根據(jù)陽性細胞所占比例進行評分：陽性細胞所占比例≤10%計1分，陽性細胞所占比例為11%～50%計2分，陽性細胞所占比例為51%～75%計3分，陽性細胞所占比例＞75%計4分。將染色程度評分與陽性細胞所占比例評分相乘，乘積＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測FOXD3蛋白表達

取胃癌組織和癌旁組織標本各5 g，剪碎，選用PBS洗滌2次，并置于勻漿器內(nèi)，滴入5 ml蛋白裂解液，開啟振蕩模式，時間設(shè)置為15 min，取出樣本置于95℃溫箱內(nèi)進行滅活，3500 r/min離心12 min，取上清，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，加入FOXD3一抗，-7℃冷藏過夜，洗膜緩沖液洗滌2次，加入山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，孵育60 min，TBST再次洗膜，發(fā)光并通過美國賽默飛E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXD3蛋白陽性表達率的比較

胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率為30.5%（36/118），明顯低于癌旁組織的69.5%（82/118），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=35.262，P＜0.01）；免疫組化染色結(jié)果顯示，胃癌組織中可見少量棕黃色顆粒，癌旁組織中棕黃色顆粒較多（圖1）。

圖1 胃癌組織和癌旁組織中FOXD3蛋白的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 FOXD3蛋白表達水平的比較

胃癌組織中FOXD3蛋白相對表達量為（0.68±0.13），明顯低于癌旁組織的（1.26±0.18），差異有統(tǒng)計學意義（t=28.644，P＜0.01）。（圖2）

注：1～4.癌旁組織；5～8.胃癌組織

2.3 胃癌組織中FOXD3蛋白陽性表達與胃癌患者臨床特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度為T3～4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分化程度為低分化胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率分別低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、浸潤深度為T1～2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分化程度為高-中分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但不同病灶直徑胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白陽性表達情況的比較（n=118）

3 討論

FOXD3早期被稱為“Genesis”，有關(guān)Forkhead/Winged helix的國際會議根據(jù)DNA結(jié)合域的氨基酸序列分布特征，對叉頭框蛋白家族進行系統(tǒng)命名，F(xiàn)OXD3才開始被臨床所認可[6]。FOXD3具有維持胚胎發(fā)育的功能，研究表明，F(xiàn)OXD3可于胚胎干細胞及其惡性等價物胚胎瘤細胞中表達[7]。一項基于裸鼠模型的FOXD3移植實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3具有成瘤性，其可以促進細胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化，表明FOXD3可能成為一種新型腫瘤干細胞表面標志物[8]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率和相對表達量均明顯低于癌旁組織（P＜0.01）。相關(guān)研究結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)OXD3可以提高成纖維細胞的增殖速度，且S期細胞所占比例增高，表明下調(diào)FOXD3表達可能增強了成纖維細胞的DNA合成活性，促進細胞增殖；隨后，該研究將FOXD3沉默后穩(wěn)定細胞株注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有小鼠均出現(xiàn)成瘤現(xiàn)象，并且瘤體增長速度較快，腫瘤干細胞核分裂相活躍，倍增時間為1.1天[9]；提示FOXD3可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

FOXD3可以與DNA上的多種受體相結(jié)合，并且還可以在細胞分化時表達，因此FOXD3最初被當做轉(zhuǎn)錄抑制因子[10-11]。FOXD3可以抑制胚胎干細胞中與分化作用有關(guān)的基因表達，維持胚胎干細胞的功能；由于腫瘤干細胞與胚胎干細胞具有極高的生物學相似度，因而，F(xiàn)OXD3也可能通過抑制干細胞中與分化作用有關(guān)的基因來阻滯細胞的分化成熟，使細胞周期停止于某一個階段，即惡性化[12-13]。相關(guān)研究表明，敲除FOXD3基因的胚胎細胞無法用于體外建立胚胎干細胞系統(tǒng)，并且敲除FOXD3基因的上胚層細胞惡性誘導(dǎo)能力明顯下降[14]，表明FOXD3是胚胎期胚胎干細胞活化及功能維持的重要因子。本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度為T3～4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分化程度為低分化胃癌患者胃癌組織中FOXD3蛋白的陽性表達率分別低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、浸潤深度為T1～2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分化程度為高-中分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示FOXD3或許可以用于評估胃癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。陳勇等[15]研究顯示，胃癌患者的分化程度越高，F(xiàn)OXD3的表達水平越低，提示FOXD3可能與胃癌的分化程度有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。但由于本研究納入的樣本量較少，且樣本來源地域狹窄，因而尚存在一定不足。

綜上所述，胃癌組織中FOXD3表達水平明顯降低，且與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，值得臨床進一步研究。