分子鑒定技術(shù)在南藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展

朱美玲 王林娜 胡培 林勵(lì) 楊光義

摘要 “南藥”是我國(guó)中藥資源的重要組成部分，近年來，南部諸省均積極尋求“南藥”道地藥材產(chǎn)業(yè)之路，但“南藥”植物資源種類和數(shù)量不清、種質(zhì)資源難保存、野生資源遭受嚴(yán)重破壞、人工栽培品種品質(zhì)退化等問題嚴(yán)重制約了“南藥”產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。分子鑒定技術(shù)是近年來興起的一種鑒定技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。本文對(duì)常用的分子鑒定技術(shù)進(jìn)行了分析總結(jié)，從遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析、正偽替及多基原鑒定、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)4個(gè)方面對(duì)分子鑒定技術(shù)在“南藥”中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)，為“南藥”產(chǎn)業(yè)今后的發(fā)展方向提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 分子鑒定技術(shù)；南藥；遺傳多樣性；親緣關(guān)系；種質(zhì)資源；真?zhèn)舞b別

Abstract “Nanyao” is an important component of Chinese medicine resource. In recent years， provinces in the south of China have actively sought the path of the genuine regional drug industry of “Nanyao”， which has been seriously restricted by the existent problems that the species and quantity of “Nanyao” herb resources are not clear， and the germplasm resources are hard to preserve. The wild resources are severely damaged and the quality of cultivated varieties is degraded. Molecular identification technology is a new identification technique that has been widely applied in recent years， with the advantages of high accuracy and good repeatability. In this paper， the commonly used molecular identification techniques were analyzed and summarized， and the application of molecular identification techniques in “Nanyao” was analyzed from four aspects： genetic diversity analysis， genetic relationship analysis， germplasm resources evaluation， and the identification of genuine medicine， substitute， counterfeit species， multi-source one， aiming at providing the basis for the development of “Nanyao” industry.

Key Words Molecular identification technology； “Nanyao”； Genetic diversity analysis； Genetic relationship analysis； Germplasm resources evaluation； Identification

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.067

中醫(yī)藥是中華民族的寶貴財(cái)富，“南藥”特指生長(zhǎng)在我國(guó)秦嶺以南的中草藥。從晉代古籍稽含《南方草本狀》（公元304年前后），唐末五代李珣《海藥本草》（公元9世紀(jì)末至10世紀(jì)初），至民國(guó)時(shí)期蕭步丹《嶺南采藥錄》（1932年復(fù)印本），胡真《山草藥指南》（1942年復(fù)印本）[1]所述大都為中國(guó)國(guó)內(nèi)南方的藥材，特別是嶺南草藥，但廣義上的“南藥”亦涉及東南亞、南非等地的一些藥材。就中國(guó)國(guó)內(nèi)而言，長(zhǎng)江以南的熱帶、亞熱帶地區(qū)，大體以緯度25°為界，通常是廣東（含海南）、廣西、福建南部、云南、臺(tái)灣、港澳等地所產(chǎn)的道地藥材，稱之為“南藥”[2]。如化橘紅、廣陳皮、陽(yáng)春砂、廣藿香、巴戟天、沉香、廣佛手、何首烏八大“南藥”。

國(guó)家對(duì)“南藥”的重視由來已久：1969年，商業(yè)部、外貿(mào)部、農(nóng)墾部、林業(yè)部、衛(wèi)生部、財(cái)務(wù)部六部委聯(lián)合發(fā)文《關(guān)于發(fā)展南藥生產(chǎn)問題的意見》，列出植物類南藥34種；1970年首屆南藥會(huì)議在廣東湛江召開；國(guó)家有關(guān)部委曾召開了四屆全國(guó)南藥會(huì)議；1975年商業(yè)部、農(nóng)林等部發(fā)出《關(guān)于發(fā)展南藥生產(chǎn)十年規(guī)劃的意見》。近年來，廣東、廣西、云南、海南、福建等省區(qū)都在積極尋求發(fā)展“南藥”道地藥材產(chǎn)業(yè)之路，希冀借助“南藥”品牌增強(qiáng)各自的中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[3]。為了更好的保障“南藥”產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，確?！澳纤帯钡馁|(zhì)量以及臨床用藥的安全性和有效性，對(duì)“南藥”進(jìn)行基原鑒定，顯得尤為重要。中藥材傳統(tǒng)的鑒定方法主要是依靠老藥工的眼看、手摸、鼻聞、口嘗，以經(jīng)驗(yàn)鑒別為主，而中藥飲片的性狀特征不突出，不確定因素太多，而化學(xué)特征也會(huì)因各個(gè)藥材特異性強(qiáng)，研究中建立的方法一般不通用。因道地藥材以數(shù)量遺傳性狀為主，在基因水平表現(xiàn)為多基因構(gòu)成的數(shù)量遺傳，發(fā)現(xiàn)道地藥材的特定分子特征，對(duì)其穩(wěn)定的遺傳特征進(jìn)行描述，是道地藥材今后發(fā)展的方向。

DNA作為遺傳信息的直接載體，不受外界因素、生物發(fā)育階段或器官組織差異的影響，既拋開形態(tài)相似的表象，又可避免化學(xué)特征的過于多變，而從基因水平上提供一種鑒別依據(jù)，具有更加準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)；容易找到種級(jí)的鑒定特征，甚至可以進(jìn)行種下等級(jí)的鑒定[4]。黃璐琦[5]將分子生物學(xué)與中藥資源研究有機(jī)結(jié)合，應(yīng)用Cytb序列對(duì)蘄蛇和烏梢蛇進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒別，有效地將二者區(qū)分。陳士林等[6]研究的ITS2序列已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于中藥鑒定研究中，大量的ISSR、RAPD、AFLP技術(shù)在中藥材遺傳多樣性方面也已經(jīng)成熟。2010年版和2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》已正式收載了烏梢蛇、蘄蛇和川貝母的DNA分子鑒別方法及中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則，標(biāo)志著中藥分子鑒定方法成為繼四大經(jīng)典鑒別方法之后的第五大國(guó)家法定鑒定方法[7]。正逐步成為中藥鑒定的主要手段[8]。本文對(duì)常用分子生物學(xué)技術(shù)及其在南藥中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為“南藥”道地藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 常用的分子鑒定技術(shù)

1.1 基于PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)

DNA指紋圖譜是一個(gè)可以反映基因組DNA特征的技術(shù)，通過DNA指紋圖譜技術(shù)將基因組特征圖像化，便可獲得生物DNA的“指紋”。比較各物種的特異圖譜，可了解它們的相似性或差異，從而做出鑒定。

1.1.1 RAPD技術(shù) RAPD即隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic，DNA），是由美國(guó)的2個(gè)研究小組于1990年同時(shí)提出的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。William等[9]第一次用任意序列的10個(gè)堿基的寡糖核苷酸作單引物，以未知系列的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增可獲得一組不連續(xù)的DNA片段。并將這種以隨機(jī)引物作擴(kuò)增的技術(shù)稱為隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。Welsh等[10]用20～30個(gè)堿基的任意引物，成功獲得DNA指紋圖譜，并命名為任意引物聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Arbitrarily Primed-PCR，AP-PCR）。RAPD技術(shù)具適應(yīng)性廣、簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，對(duì)受試基因組無(wú)特定要求，無(wú)需雜交、基因克隆、測(cè)序等步驟，自問世以來，科研人員在將其應(yīng)用于中藥材鑒定方面開展了大量的研究工作，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于生物的品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究上[11]。

1.1.2 ISSR技術(shù) 1994年Zietkeiwitcz等[12]針對(duì)廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的簡(jiǎn)單系列重復(fù)（Simple Sequence Repeat，SSR），設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)單系列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（Inter-simple Sequence Repeat，ISSR）。其基本原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3′端或5′端加上2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ISSR標(biāo)記技術(shù)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、高效，不需要繁瑣的構(gòu)建基因文庫(kù)、雜交和同位素顯示等步驟，現(xiàn)己廣泛應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源鑒定、進(jìn)化與親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)、遺傳作圖、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究[13]。

1.1.3 AFLP技術(shù) 1995年Vos等[14]發(fā)明了一種集PCR和RFLP優(yōu)點(diǎn)于一身的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）。是利用限制性內(nèi)切酶（單酶切或雙酶切）能夠把樣品基因組DNA酶切成大小不同的片段，設(shè)計(jì)合成雙鏈人工接頭與酶切片段相連接。以接頭和酶切位點(diǎn)序列的互補(bǔ)堿基再增加1～3個(gè)選擇性堿基作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的不同大小片段需要進(jìn)行變性，再經(jīng)含尿素的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)放射自顯影或銀染或熒光技術(shù)呈現(xiàn)DNA指紋圖譜[15]。AFLP技術(shù)具有重復(fù)性好、多態(tài)性高的優(yōu)點(diǎn)。但因該技術(shù)對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高、操作復(fù)雜，且費(fèi)用昂貴，在藥材鑒定中的應(yīng)用沒有其他分子標(biāo)記方法廣泛。

1.1.4 SRAP技術(shù) 2001年Li和Quiros H[16]發(fā)展了一種新型的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence Related Amplified Polymorphrism，SRAP），該標(biāo)記通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORFs（Open Reading Frames）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物長(zhǎng)17 bp，對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。下游引物長(zhǎng)18 bp，對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效、產(chǎn)率高、高共顯性、重復(fù)性好、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)。目前已成功地應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的標(biāo)記以及相關(guān)基因的克隆等方面[17]。DNA指紋技術(shù)具有操作簡(jiǎn)易、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可為中藥鑒定提供更加準(zhǔn)確可靠的手段，尤其是它可以在不知道特異DNA序列的情況下檢測(cè)DNA的多態(tài)性。目前，在絕大多數(shù)動(dòng)、植物中藥材DNA序列尚不清楚的情況下，DNA指紋技術(shù)在中藥品種鑒定研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.2 DNA測(cè)序技術(shù)和條形碼技術(shù) DNA測(cè)序（DNA sequence）是將基因片段上每一個(gè)堿基序列直接展示。利用DNA測(cè)序獲得排序結(jié)果，按照排序結(jié)果構(gòu)建的物種親緣關(guān)系可以用于不知名物種的鑒定。具體方法是對(duì)樣本及已鑒定標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，繪制出分子系統(tǒng)樹，不知名樣本會(huì)跟進(jìn)化差異最小的物種組成一個(gè)散群（cluster），由此判斷樣本的真正身份。Bartlett等[18]于1992年在此邏輯上發(fā)展了一套“法證信息核苷酸測(cè)序法”（Forensically Informative Nucleotide Sequencing，F(xiàn)INS），1994年Forrest和Carnegie對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化[19]?！吧鼦l形碼聯(lián)盟”（CBOL）于2003年提出線粒體的細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1（Cytochrome C oxidase Subunit 1 mitochondrial region，COI）是鑒定昆蟲和動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)序列，這種生物品種鑒定方法即為DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding）。2008年該組織又確立了以葉綠體的rbcL及matK患者基因?yàn)橹参锏臈l形碼[20]。目前采用DNA條形碼對(duì)植物類中藥進(jìn)行分子鑒定，多以ITS2序列為主，以psbA-trnH序列為輔；動(dòng)物類中藥鑒定多以CO序列為主，ITS2為輔助序列。

1.3 基于PCR的高通量核酸雜交技術(shù) 生物芯片（如DNA chip）或DNA微陣列（DNA microarray）是一種高通量的檢測(cè)平臺(tái)，在生物芯片上，同時(shí)進(jìn)行海量的核酸雜交實(shí)驗(yàn)，觀察基因數(shù)據(jù)。由于中藥材的生物來源廣，該技術(shù)正好為高通量鑒定開辟出一條新道路。Liu等[21]利用18SrRNA基因序列特異性探針對(duì)半夏Pinellia ternate及其偽品虎掌（掌葉半夏）P.pedatisecta的鑒定；Zhu等[22]利用18SrRNA基因序列特異性探針對(duì)人參屬植物與生藥的鑒定。5SrRNA間隔區(qū)和26SrRNA基因D2、D3區(qū)特異性探針對(duì)貝母屬Fritillaria的鑒定[23]；5SrRNA間隔區(qū)和ITS2特異性探針對(duì)石斛屬Dendrobium的成功鑒定[24-25]。目前采用DNA芯片技術(shù)成功鑒定的研究雖不多，但也表明DNA芯片技術(shù)可為植物種屬鑒定提供快速、高通量的工具。

2 分子生物技術(shù)在南藥中的應(yīng)用

2.1 遺傳多樣性分析 物種或居群的遺傳多樣性大小是長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，是其生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提。一個(gè)居群或物種遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)越；也就越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境。朱華等[26]以同一產(chǎn)地的2種青天葵生藥樣品為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其種間遺傳多樣性進(jìn)行分析，研究表明利用RAPD技術(shù)可以靈敏地檢測(cè)出種間遺傳多樣性，并對(duì)二者加以鑒別。楊春勇等[27]采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析了海南、云南、廣東、廣西等地17份沉香屬植物的遺傳多樣性，從篩選出的8對(duì)引物中檢測(cè)到919個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為86.94%，揭示沉香屬植物具有較高的遺傳多樣水平。鄒穎[28]采用SSR標(biāo)記對(duì)南藥益智的19個(gè)居群共431份樣品進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明，遺傳多樣性略高于平均水平，居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間的遺傳分化，說明益智居群間不存在基因交流障礙，且存在一定程度的近交。楊全等[29]采用AFLP技術(shù)對(duì)8個(gè)種源地的高良姜進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)高良姜種質(zhì)間存在較高多態(tài)性，遺傳多樣性豐富；為探求各種質(zhì)間的親緣關(guān)系，合理利用種質(zhì)資源及優(yōu)良品種選育奠定理論基礎(chǔ)。Wang H等[30]用ISSR法對(duì)益智7個(gè)居群共163個(gè)個(gè)體進(jìn)行研究，結(jié)果表明廣東益智居群和海南五指山益智居群遺傳進(jìn)化比較原始，其中五指山居群具有較高的遺傳多樣性。對(duì)遺傳多樣性的研究可以揭示物種或居群的進(jìn)化歷史，也能為進(jìn)一步分析其進(jìn)化潛力和未來的命運(yùn)提供重要的資料，尤其有助于物種稀有或?yàn)l危原因及過程的探討。

2.2 偽、替及不同基原的鑒定 中藥材種類繁多，常有中藥的正、替、偽品混淆使用，以致干擾療效，甚至導(dǎo)致中藥中毒事故；尋找操作方便、可信度高的鑒定方法來鑒別中藥材的真?zhèn)螌?duì)于臨床安全用藥極為重要。杜勤等[31]對(duì)22個(gè)青天葵樣品及偽品進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干藥材中小葉與中葉距離較近，與大葉及毛葉距離遠(yuǎn)。新鮮葉片中3種青天葵為一類，青天葵與其組培品、毛葉與紅薯葉距離稍遠(yuǎn)，與車前草、積雪草距離最遠(yuǎn)，說明不同品種青天葵間及偽品在分子水平上存在差異，應(yīng)用此方法可成功鑒別青天葵。黃瓊林等[32-34]基于DNA條形碼鑒別技術(shù)對(duì)3種青天葵及4種混偽品的鑒別作了深入研究，通過ITS2、rbcL、matK條形碼序列信息的分析表明，基于這3條序列均能直觀地區(qū)別青天葵及其混偽品種；應(yīng)用matK序列能完全鑒別供試的7個(gè)物種。焦文靜[35]等對(duì)砂仁3個(gè)基原共計(jì)60份材料ITS2序列進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同基原在135 bp和199 bp處存在穩(wěn)定SNP變異位點(diǎn)，根據(jù)這2個(gè)穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)可以快速準(zhǔn)確地鑒定砂仁藥材3個(gè)基原。衛(wèi)瀅等[36]對(duì)巴戟天及其3種近緣植物的ITS2和psbA-trnH序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ITS2序列上種間變異大于種內(nèi)變異，能準(zhǔn)確鑒別出全部供試物種；psbA-trnH序列上種間變異大于種內(nèi)變異，僅能準(zhǔn)確鑒別出海濱木巴戟和羊角藤。應(yīng)用傳統(tǒng)的鑒別方法難以進(jìn)行“南藥”的多基原鑒定及親緣關(guān)系近的正品、替代品的鑒別，分子鑒定技術(shù)可從基因水平上對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，為“南藥”鑒定提供依據(jù)。

2.3 親緣關(guān)系分析 植物在漫長(zhǎng)的演化過程中，形成了或遠(yuǎn)或近的親緣關(guān)系，親緣相近的種不僅體現(xiàn)在形態(tài)上的相似，同時(shí)，還體現(xiàn)在生理生化特性上的相似，因而所含的化學(xué)成分，作為植物的次生代謝產(chǎn)物，往往也比較相似，也就是說親緣相近的種生物活性和療效往往具有很大的相似性[45]。梁文匯[37]等采用ISSR標(biāo)記技術(shù)研究11個(gè)肉桂（Cinnamomum cassia）家系之間的親緣關(guān)系，結(jié)果表明這11個(gè)份樣本親緣關(guān)系相對(duì)較近，為解決肉桂資源分類和系統(tǒng)學(xué)關(guān)系的分歧問題提供了一定的分子學(xué)依據(jù)。戰(zhàn)晴晴等[38]建立了檳榔SSR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增結(jié)果清晰且有較高的多態(tài)性，表明該體系適合檳榔的親緣關(guān)系分析，為檳榔種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性的研究奠定了基礎(chǔ)。嚴(yán)寒靜等[39]采用PCR直接測(cè)序法，測(cè)定了10個(gè)種源何首烏的核糖體DNA ITS區(qū)序列，并結(jié)合GenBank中相關(guān)植物的ITS序列應(yīng)用遺傳距離與系統(tǒng)樹分析法對(duì)不同種源何首烏的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果說明10個(gè)種源何首烏構(gòu)成2個(gè)分支，廣西田陽(yáng)種源自成一支，與其他種源親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。黃瓊林等[40]利用ISSR-PCR方法對(duì)陽(yáng)春砂栽培品種長(zhǎng)果、圓果和“春選”與海南砂進(jìn)行基因組多態(tài)性分析，結(jié)果證明“春選”與海南砂有著較近的親緣關(guān)系，建立基于ISSR分析的陽(yáng)春砂遺傳分析方法，為陽(yáng)春砂的品種鑒別和優(yōu)良品種選育提供了依據(jù)。研究“南藥”植物的親緣關(guān)系為“南藥”植物資源分類及系統(tǒng)學(xué)關(guān)系提供依據(jù)，對(duì)優(yōu)良品種的選育及開發(fā)新的藥用植物資源具有重要的指導(dǎo)意義。

2.4 種質(zhì)資源評(píng)價(jià) 種質(zhì)資源又稱遺傳資源。種質(zhì)是指生物體親代傳遞給子代的遺傳物質(zhì)，它往往存在于特定品種之中。種質(zhì)資源的范圍包括古老的地方品種、新培育的推廣品種、重要的遺傳材料以及野生近緣植物等，是在遺傳、育種、生產(chǎn)上有利用價(jià)值的一切植物材料。丁平等[41]利用RAPD技術(shù)對(duì)巴戟天5個(gè)不同農(nóng)家類型的種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同農(nóng)家類型巴戟天種質(zhì)資源在分子水平上存在明顯的遺傳差異；趙俊生等[42]對(duì)21份化橘紅及3份近緣種質(zhì)蜜柚和黃皮的25個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型，結(jié)果表明，21個(gè)SNP位點(diǎn)可將24份樣本分為3類，化州橘紅種質(zhì)單獨(dú)聚為一類，表明SNP分子標(biāo)記將成為化州橘紅種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及品種鑒定的一項(xiàng)重要工具，為化橘紅種質(zhì)資源鑒定提供了有效的方法和依據(jù)。潘坤等[43]采用了ISSR分子標(biāo)記對(duì)96份海南高良姜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，結(jié)果說明海南高良姜栽培種的遺傳多樣性較低，此研究可為高良姜種質(zhì)資源的收集、分類、以及GAP基地建設(shè)等提供一定的理論依據(jù)。對(duì)“南藥”種質(zhì)資源的研究為藥用植物的栽培、育種、貯運(yùn)與加工等提供重要的理論依據(jù)。

3 展望

“南藥”藥用植物種質(zhì)資源豐富，但在開發(fā)利用過程中存在種類和數(shù)量不清、種質(zhì)資源難保存、野生資源遭受嚴(yán)重破壞、人工栽培品種品質(zhì)退化等問題，嚴(yán)重制約了“南藥”產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而解決這些問題的關(guān)鍵是要有一套簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確有效的鑒定技術(shù)，以杜絕假、劣以及混淆品的干擾。

目前，“南藥”藥用植物研究?jī)?nèi)容主要包括種質(zhì)資源的鑒定、親緣關(guān)系的劃分及遺傳起源與演化等，其最終目的在于優(yōu)良品種的選育，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)中藥材，而育種上的突破性進(jìn)展主要依靠DNA分子水平的研究進(jìn)展。分子鑒定技術(shù)正飛速發(fā)展，并逐漸滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，且被證實(shí)是一種評(píng)價(jià)種屬間遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效方法[44]，為“南藥”的研究提供了新思路。

分子鑒定技術(shù)可以從基因水平上提供鑒別依據(jù)，具有準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)；將分子生物學(xué)技術(shù)與“南藥”藥用植物的研究相結(jié)合，必將成為“南藥”研究的重要手段。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于“南藥”的研究還屬于起步和發(fā)展階段，因此要實(shí)現(xiàn)各“南藥”近緣種、混偽品的分子鑒定，全面揭示“南藥”遺傳多樣性及品種間的親緣關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。隨著科學(xué)的進(jìn)步和研究的不斷深入，相信分子生物學(xué)技術(shù)必將成為研究“南藥”的主流技術(shù)，為南藥產(chǎn)業(yè)更好、更快的發(fā)展提供有力的支持與保障。

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