傳統(tǒng)中藥材麥冬的DNA條形碼鑒定

王廣艷

摘 要：該文分析了DNA條形碼序列（ITS、psbA-trnH、matK、rbcL和trnL-F）對采自10個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的麥冬進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序。結(jié)果表明，ITS序列變異位點(diǎn)為11 bp且較穩(wěn)定。葉綠體序列的變異位點(diǎn)較低。本研究構(gòu)建了ITS及聯(lián)合葉綠體片段與ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹，4個(gè)葉綠體片段各自構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果不理想，以ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹為主。廣西桂林、貴州貴定與浙江余杭聚為一支；四川什都、四川珙縣與廣東肇慶聚為一支；云南麻栗坡與云南石林聚為一支；江西廬山與湖南桑植聚為另一分支，位于發(fā)育樹基部；以上分支均得到G+C含量和遺傳距離的支持，種內(nèi)具有較近的親緣關(guān)系。ITS序列具有穩(wěn)定的變異位點(diǎn)和鑒定位點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確的鑒定不同產(chǎn)地的麥冬，基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠較好的區(qū)分其親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：麥冬；ITS；葉綠體片段；遺傳距離；親緣關(guān)系

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）24-0017-05

DNA Barcoding Technique to Identify Traditional Chinese Medicinal Materials Ophiopogon japonicas（L.f.）Ker-Gawl.

Wang Guangyan

（School of Life Sciences，the Province Key Laboratory of the Biodiversity Study and Ecology Conservation in Southwest Anhui，Anqing Normal University，Anqing 246011，China）

Abstract：DNA barcoding sequences（ITS，psbA-trnH，matK，rbcL，and trnL-F）were used to study O.japonicus from 10 different regions by PCR technique. The results showed that sequence variable sites of ITS were 11 bp and stable.Variable sites of chloroplast were low.In this study，the ITS and ITS+chloroplast phylogenetic trees were constructed，the phylogenetic trees based on chloroplast fragments were poor.ITS phylogenetic tree was dominant.O.japonicas from Guilin in Guangxi，Guiding in Guangzhou and Yuhang in Zhejiang comprised one closely clade；from Shendu in Sichuan，Gongxian in Sichuan and Zhaoqing in Guangzhou formed a closer clade；from Malipo in Yunnan and Shilin in Yunnan grouped into one closely clade；and from Lushan in Jiangxi and Sangzhi in Hunan formed another closely clade.All above clades were supported by G+C contents and genetic distances，and had closely relationships. The ITS sequence had stable variable sites and informative sites，and could accurately indentify O.japonicas from 10 different regions. The ITS phylogenetic tree could provide reliable genetic relationships.

Key words：Ophiopogon japonicas；Internal Transcribed Spacer；Chloroplast fragment；Genetic distance；Genetic relationship

麥冬為天門冬科（Asparagaceae）沿階草屬（Ophiopogon Ker-Gawl.）植物，其干燥塊根具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心之功效，用于治療肺燥干咳、虛勞咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、內(nèi)熱消渴和咽白喉等癥狀，收藏于中華人民共和國藥典中[1]，其正品是Ophiopogon japonicus（L.f.）Ker-Gawl.。主產(chǎn)于浙江、四川、安徽、江西、湖南、河南等地，浙江、四川、廣西等地均有栽培[2]。由于栽培環(huán)境與野生狀態(tài)不同，其塊根在形態(tài)上發(fā)生了部分變異，栽培品種較粗壯，野生品種較細(xì)小。隨著麥冬栽培地區(qū)的擴(kuò)大，流通品系增多，亟待對各品系進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)研究。

DNA條形碼（DNA barcoding）于2003年首次被作為物種鑒定的依據(jù)[3，4]，并引起全世界科學(xué)界的關(guān)注[5-9]。DNA條形碼鑒定是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段，對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識別和鑒定的有效手段，具有鑒定過程快、操作簡單、重復(fù)性和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[10，11]。一些學(xué)者認(rèn)為線粒體基因以及核基因中的單拷貝基因和內(nèi)含子不可以作為物種鑒定的依據(jù)，原因是線粒體基因的變異率較低以及變異結(jié)構(gòu)較少[12-16]，核基因中的單拷貝基因和內(nèi)含子缺乏通用引物的擴(kuò)增[16]。rDNA ITS（rDNA internal transcribed spacer）區(qū)是核糖體DNA上的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括5.8S rDNA、ITS1（18S和5.8S之間）和ITS2（5.8S和16S之間），其長度比較保守，核苷酸序列變化較大，可以提供豐富的系統(tǒng)學(xué)信息，能反映種間差別和物種進(jìn)化程度，且不易受藥材加工而完全降解等特點(diǎn)，被廣泛用于屬間、種間及居群間的分子系統(tǒng)學(xué)及分子鑒定研究[17-19]。一些研究結(jié)果表明葉綠體基因（psbA-trnH、matK、rbcL和rpoC1）也可作為物種鑒定的依據(jù)[12，16，20-22]。

目前針對藥用植物麥冬DNA條形碼序列分析和鑒定的研究還較少，為此，本研究選取核基因（ITS）及葉綠體基因（psbA-trnH、matK、rbcL和trnL-F）對10個(gè)來源不同的麥冬進(jìn)行序列測定，比較核基因和葉綠體基因序列，找出能準(zhǔn)確鑒定麥冬的序列及鑒別位點(diǎn)，從分子水平上比較不同地區(qū)麥冬的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)選取10份不同來源地的麥冬材料。各樣品采集地點(diǎn)見表1。憑證標(biāo)本藏于中國科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館（KUN）。

1.2 DNA的提取與PCR擴(kuò)增 總DNA的提取采用試劑盒法（Bioteke，Beijing，China）。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增反應(yīng)為25μL體系：0.5μL（10ng）DNA，0.5μL（4pmol）引物，0.5μLTaq酶（Promega），2μL2.5mM dNTP，2.5μL10×PCR Buffer，18.5μLH2O。用于PCR擴(kuò)增和測序的引物以及擴(kuò)增程序如下：1）ITS序列的引物用ITS4和ITS5，對于擴(kuò)增不成功的樣品，進(jìn)一步用內(nèi)含引物ITS2和ITS3[23]，把ITS分為兩個(gè)更短的片段來擴(kuò)增：MF+ITS2和ITS3+MR，由于沿階草屬與鹿藥屬較為近緣，其中的MF（5' TCGAGACCCGAACGGACRAT 3'）和MR（GTGCTCGGCATGGGTTCCTT）引自Meng等[24]，94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min，保持溫度為4℃；（2）psbA-trnH序列的引物用psbA-F和trnH-R[25，26]，94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，49℃退火30s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min，保持溫度為4℃；（3）rbcL序列的引物用Z1和1024R[27，28]，94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min，保持溫度為4℃；（4）matK序列的引物用3F和1R[29]，94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，31個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min，保持溫度為4℃；（5）trnL-F序列的引物用Tab-c和Tab-f[30]，94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，31個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min，保持溫度為4℃。取5μLPCR產(chǎn)物在加有EB熒光染料的濃度為1%的瓊脂糖凝膠中做電泳實(shí)驗(yàn)（110～230V）20min左右，在紫外光下照相，將條帶清楚的PCR產(chǎn)物送公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理 DNA序列的排序用Bioedit（ver.7.0.4.1）軟件完成，排序后用MEGA（ver.7.0）軟件基于Kimura2-parameter模型計(jì)算遺傳距離，并采用類平均法（UPMEG）在MEGA（ver.7.0）軟件中構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度自舉檢測（bootstrap）1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基序列分析 10份麥冬樣品序列比對后結(jié)果列于表2和表3。ITS序列的全長變化范圍為600～699bp，平均G+C含量為9.96%，序列變異位點(diǎn)為11bp，信息位點(diǎn)比率為0.10%。其中，A占15.31%，T占18.08%，G占32.63%，C占33.98%。嘌呤的轉(zhuǎn)換顛換率為K1=9.621，嘧啶的轉(zhuǎn)換顛換率為K2=15.213。一般親緣關(guān)系接近的物種具有更高的轉(zhuǎn)換差異比例，這種差異在親緣關(guān)系接近的類群中更為顯著[31]。麥冬的ITS序列的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2，與2個(gè)編碼區(qū)5.8S和26S的界限參照Maianthemum dahuricum（Turcz.ex Fisch.et C.A.Mey.）LaFrankie[24]的序列資料確定。測定了10個(gè)產(chǎn)地樣品的ITS1、5.8S和ITS2全序列，其中ITS1序列長度為257～281bp，平均G+C含量為27.23%；ITS2為224～230bp，平均G+C含量為30.05%。所有類群ITS序列的5.8S區(qū)長度均為143bp，平均G+C含量為36.94%。大部分序列變異發(fā)生在間隔區(qū)，5.8S區(qū)域很少發(fā)生變異。通常，G+C含量是反映親緣關(guān)系的重要依據(jù)，親緣關(guān)系越親近其G+C含量相差越小[32]。從表2中可以發(fā)現(xiàn)，10種麥冬ITS區(qū)G+C含量為9.40%～11.17%，ITS1區(qū)G+C含量為25.96%～33.87%，ITS2區(qū)G+C含量為29.68%～30.89%，均差異較小，暗示不同產(chǎn)區(qū)麥冬遺傳差異較小。這與堿基轉(zhuǎn)換比率得出的結(jié)論一致。

psbA-trnH序列的全長變化范圍為642～643bp，序列變異位點(diǎn)為1bp，信息位點(diǎn)比率為0.16%。其中，A占29.63%，T占34.10%，G占18.52%，C占17.76%。嘌呤的轉(zhuǎn)換顛換率為K1=8.113，嘧啶的轉(zhuǎn)換顛換率為K2=0。matK序列全長的變化范圍為864～868bp，序列變異位點(diǎn)為42bp，信息位點(diǎn)比率為0%。其中，A占38.00%，T占29.94%，G占16.87%，C占15.19%。嘌呤的轉(zhuǎn)換顛換率為K1=4.826，嘧啶的轉(zhuǎn)換顛換率為K2=2.836。rbcL序列的全長變化范圍為1 099～1 130bp，序列變異位點(diǎn)為10bp，信息位點(diǎn)比率為0.35%。其中，A占27.96%，T占29.44%，G占23.26%，C占19.34%。嘌呤的轉(zhuǎn)換顛換率為K1=2.375，嘧啶的轉(zhuǎn)換顛換率為K2=0。trnL-F序列全長的變化范圍為927～933bp，序列變異位點(diǎn)為38bp，信息位點(diǎn)比率為0.53%。其中，A占36.01%，T占31.90%，G占16.22%，C占15.87%。嘌呤的轉(zhuǎn)換顛換率為K1=24.245，嘧啶的轉(zhuǎn)換顛換率為K2=52.473（表3）。

2.2 麥冬種內(nèi)遺傳距離分析 各產(chǎn)區(qū)麥冬樣品的ITS序列之間的遺傳距離見表4，遺傳距離范圍為0.001～0.022。浙江余杭與廣西桂林、廣西桂林與貴州貴定間的遺傳距離均為0.001，表明三者間親緣關(guān)系較近；貴州貴定與江西廬山間的遺傳距離為0.022，暗示兩者間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。psbA-trnH遺傳距離的范圍為-0.000～0.003；matK遺傳距離的范圍為-0.000～0.048；rbcL遺傳距離的范圍為-0.000。-0.012；trnL-F遺傳距離的范圍為-0.000～0.039?；谌~綠體基因計(jì)算的遺傳距離均出現(xiàn)負(fù)值（具體數(shù)值不再列出），說明以上葉綠體基因均不可作為不同產(chǎn)地麥冬鑒定或親緣關(guān)系判斷的依據(jù)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以類平均法（UPMEG）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由于4個(gè)葉綠體片段的信息位點(diǎn)均較低（0～0.53%），其各自產(chǎn)生系統(tǒng)樹的結(jié)果并不理想，因此系統(tǒng)發(fā)育樹沒有展示出來。聯(lián)合的葉綠體片段與ITS的ILD檢測表明兩者并不沖突（P=0.09>0.05），因此將4個(gè)葉綠體片段與ITS聯(lián)合分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。ITS以及ITS與葉綠體聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1和圖2。圖1顯示了基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹共分成分支I和分支II兩大支，其中，分支I分成I1和I2兩支，分支I1分成I11和I12兩支，廣西桂林、貴州貴定和浙江余杭聚為分支I11，四川什都、四川珙縣和廣東肇慶聚為分支I12；云南麻栗坡和云南石林聚為I2。江西廬山和湖南桑植聚為分支II。圖2顯示了基于ITS與葉綠體聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，除四川什都、云南麻栗坡及云南石林的系統(tǒng)位置與基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)樹不同外，其它分支均與基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹一致。由于葉綠體序列的分辨率低，本研究以ITS構(gòu)建的系統(tǒng)樹為主來討論不同產(chǎn)地麥冬的親緣關(guān)系。

3 討論

3.1 核基因與葉綠體基因序列在中藥麥冬鑒定中的價(jià)值 分子生物學(xué)的發(fā)展為中藥鑒定提供了新技術(shù)和新方法，分子標(biāo)記技術(shù)從誕生至今已發(fā)展至幾十種，DNA條形碼技術(shù)是分子鑒定的最新發(fā)展。該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、微量和通用性強(qiáng)等特點(diǎn)，不受發(fā)育階段、供試部位、環(huán)境條件等外在條件的影響[33]。ITS序列因其基因片段短，高度變異且有長度上的保守性，在被子植物中被廣泛應(yīng)用[34]。越來越多的葉綠體序列也被用于藥用植物鑒定和品質(zhì)研究中，Cao等[35]通過測定三七的matK基因序列得出：matK基因序列可以成為三七正品基原鑒定的準(zhǔn)確、有效手段。Kress等[16]報(bào)道了psbA-trnH序列可以作為鑒定多種被子植物的有效序列。Newmaster等[36]從GenBank上分析了1 000多條rbcL序列，證實(shí)了rbcL序列可以有效鑒定約85%的同屬植物。

中藥麥冬外部形態(tài)特征變異較大且栽培廣泛，具有較多的野生種和栽培種。本研究表明，10個(gè)產(chǎn)區(qū)麥冬植物的ITS1和ITS2的堿基序列存在一定的變異，且變異位點(diǎn)穩(wěn)定共11bp，信息位點(diǎn)比率為0.10%。變異主要為77位的G取代A，107位的C取代T，177位的T取代C，224位的C取代A，418位的A取代G，429位的C取代T，444位的T取代C，451位的A取代G，483位的C取代T，501位的C取代T，529位的A取代C（表5）。而5.8SrDNA在麥冬不同產(chǎn)地間高度保守，均為143bp，且無變異位點(diǎn)。雖然麥冬樣品的ITS序列信息位點(diǎn)不是很高，但是穩(wěn)定的變異位點(diǎn)是麥冬鑒定的依據(jù)。同時(shí)，基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，10個(gè)產(chǎn)區(qū)的麥冬分支較為明顯，將麥冬植物分成兩大分支（圖1）。綜上所述，ITS序列可以準(zhǔn)確的鑒定不同產(chǎn)區(qū)的麥冬。

葉綠體基因psbA-trnH的變異位點(diǎn)僅為1bp，10個(gè)產(chǎn)區(qū)的麥冬序列并無顯著差異，且基于psbA-trnH構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹多為平行分支；matK基因雖然具有較高的變異位點(diǎn)42bp，但其信息位點(diǎn)為0，且構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也多為平行分支；rbcL基因雖然變異位點(diǎn)為10bp，但構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹無明顯分支；trnL-F基因雖然變異位點(diǎn)為38bp，但構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均為平行支，無明顯分支。同時(shí)，psbA-trnH的遺傳距離范圍為-0.000～0.003；matK的遺傳距離范圍為-0.000～0.048；rbcL的遺傳距離范圍為-0.000～0.012；trnL-F的遺傳距離范圍為-0.000～0.039，基于葉綠體基因計(jì)算的遺傳距離均出現(xiàn)負(fù)值（具體數(shù)值不再列出）。綜上所述，葉綠體基因psbA-trnH、matK、rbcL和trnL-F均不可作為鑒定麥冬的依據(jù)。

3.2 不同產(chǎn)區(qū)麥冬的親緣關(guān)系 不同產(chǎn)區(qū)的ITS序列存在種內(nèi)變異，基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，將不同產(chǎn)區(qū)的麥冬分成兩大分支，分支I和分支II（圖1）。其中，分支I分成分支I1和分支I2兩支。分支I2的麥冬均產(chǎn)自云南，G+C含量分別為10.45%和11.17%，G+C含量較為接近，G+C含量是反映親緣關(guān)系的重要依據(jù)，親緣關(guān)系越親近其G+C含量相差越小[32]，且兩者的遺傳距離僅為0.003，以上結(jié)果均顯示兩者的親緣關(guān)系較近。分支I1又分成I11和I12兩支。其中廣西桂林、貴州貴定和浙江余杭聚為一支，三者形態(tài)特征略有差異，可能是由于生境的差異引起的。三者的G+C含量分別為9.40%、9.41%和9.71%，廣西桂林與貴州貴定的遺傳距離為0.001，廣西桂林與浙江余杭的遺傳距離為0.001，貴州貴定與浙江余杭的遺傳距離為0.003，以上均證實(shí)三者具有較近的親緣關(guān)系。四川什都、四川珙縣和廣東肇慶聚為一支，三者的G+C含量分別為10.18%、10.18%和10.20%，四川什都和四川珙縣的遺傳距離為0.003，四川什都和廣東肇慶的遺傳距離為0.002，四川珙縣和廣東肇慶的遺傳距離為0.002，三者G+C含量非常接近以及較小的遺傳距離均支持三者聚為一支的觀點(diǎn)，以上結(jié)果均表明三者具有較近的親緣關(guān)系。分支II中的江西廬山和湖南桑植的變異尤為明顯，兩者自成單系。兩者生境較為相似，形態(tài)上無明顯分化。產(chǎn)自江西廬山的G+C含量為9.45%，產(chǎn)自湖南桑植的G+C含量為9.42%，兩者G+C含量非常接近，且遺傳距離僅為0.011，進(jìn)一步證實(shí)了兩者具有十分相近的親緣關(guān)系。本研究中，基于聯(lián)合葉綠體和ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹除四川什都、云南麻栗坡及云南石林的系統(tǒng)位置與基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)樹不同外，其它分支均與基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹一致。分支的不一致性可能是由于基因漸滲引起的。

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（責(zé)編：張宏民）