針刺對(duì)腦出血急性期血腫周圍腦組織中凋亡細(xì)胞及其百分率影響的時(shí)效關(guān)系

鄭笑男 張鐸 李平

摘要 目的：通過觀察針刺對(duì)腦出血模型大鼠血腫形成后不同時(shí)間的血腫周圍腦組織凋亡細(xì)胞及其百分率影響，研究針刺作用及其時(shí)效性的相關(guān)保護(hù)機(jī)制。方法：采用Wistar大鼠尾狀核自體血緩慢注入法制作腦出血模型。腦組織細(xì)胞凋亡率測(cè)定分別應(yīng)用TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù)。結(jié)果：腦出血急性期TUNEL陽性細(xì)胞率顯著升高，針刺各組均偏低，但高于假手術(shù)組，且針刺干預(yù)越早該比率越低；流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果基本與其一致。結(jié)論：針刺治療能夠改善腦出血急性期所造成的血腫周圍腦組織相關(guān)的凋亡情況，從而在腦出血急性期起到保護(hù)腦組織的作用，且腦出血發(fā)生后針刺干預(yù)越早療效越好。

關(guān)鍵詞 針刺；腦出血急性期；實(shí)驗(yàn)性腦血腫；細(xì)胞凋亡；TUNEL法；流式細(xì)胞術(shù)；腦保護(hù)機(jī)制；時(shí)效關(guān)系

Abstract Objective：To study the protection mechanisms of function and time-effect relationship of acupuncture method by observing apoptotic cell in cerebral hemorrhage model rats′ brain tissue around hematomas and its percentage effects at different times in acute cerebral hemorrhage.Methods：The Wistar rats model of ICH were established by infusing autologous blood into caudate nucleus through stereotaxis technique.Apoptosis rate of brain tissue was analyzed by Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and flow cytometry （FCM） methods.Results：TUNEL positive cell percentage had a significant rise at acute stage of ICH，yet the rates tended to reduce in all the groups，which was higher than that in sham-operated group，and higher acupuncture intervention with lower percentage.The result of FCM was basically consistent with it.Conclusion：Acupuncture treatment is able to ameliorate the apoptosis of brain perihematoma tissues of rats with ICH so as to protect the brain tissue from acute stage of ICH.And the earlier acupuncture intervention，the better curative effect will achieve.

Key Words Acupuncture； Acute stage of cerebral hemorrhage； Experimental cerebral hemorrhage； Apoptosis cells； TUNEL； FCM； Cerebral protection mechanisms； Time-effect relationship

中圖分類號(hào)：R245文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.044

腦出血，是指原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，是急性腦血管疾病中的危重類型，也是嚴(yán)重危害人類健康的4大疾病之一，并有較高的發(fā)病率、死亡率、致殘率與較多的并發(fā)癥，且很多研究已經(jīng)證實(shí)：它和高血壓病、高脂血癥、代謝綜合征等疾病有著密不可分的關(guān)聯(lián)。關(guān)于腦出血的病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，尚未徹底闡明。目前比較公認(rèn)的幾個(gè)重要病理環(huán)節(jié)例如血腫周圍腦組織內(nèi)Ca+超載、興奮性氨基酸與抑制性氨基酸失穩(wěn)態(tài)以及神經(jīng)興奮性毒性作用的發(fā)生等。有研究已表明，凋亡機(jī)制參與了腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)元損傷的過程，且于凋亡機(jī)制中，以上提到的相關(guān)關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)發(fā)揮了主導(dǎo)性的作用。

細(xì)胞凋亡，自從1972年被發(fā)現(xiàn)[1]以來，一直是細(xì)胞死亡研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)話題。它是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因調(diào)控的細(xì)胞自殺過程。傳統(tǒng)意義上，細(xì)胞死亡包括細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡，而二者大不相同，前者是無序變化的被動(dòng)過程，且壞死細(xì)胞會(huì)發(fā)出危險(xiǎn)信號(hào)，并引發(fā)炎性反應(yīng)，對(duì)鄰近組織造成嚴(yán)重?fù)p害[2]；后者是有序變化的主動(dòng)過程，涉及一系列基因的活化、表達(dá)及調(diào)控等的作用，但凋亡本身不屬于病理狀態(tài)下的自體損傷，而是為能更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程[3]，其生理影響及臨床意義具有重要的研究?jī)r(jià)值[4]。凋亡細(xì)胞有其獨(dú)特形態(tài)和生化特征：細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，DNA廣泛降解斷裂；細(xì)胞全面皺縮，細(xì)胞膜皺縮外突、包裹線粒體等細(xì)胞器、核片段形成凋亡小體[5]。細(xì)胞凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全明了，但總體上可以分為起始和效應(yīng)2個(gè)階段。細(xì)胞凋亡的起始階段是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后胞內(nèi)一系列開關(guān)的開啟或關(guān)閉；而凋亡一旦進(jìn)入效應(yīng)階段則不可逆轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡與許多學(xué)科都有著密切的聯(lián)系，包括發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)等。從臨床醫(yī)學(xué)角度而言，許多疑難病癥[6-14]的發(fā)病機(jī)制如血液病、艾滋病、腫瘤、自身免疫性疾病、膠原病、腦血管障礙、心血管疾病、肝臟疾病、皮膚病等均可通過細(xì)胞凋亡機(jī)制被揭示[15]。

近些年來，中醫(yī)治療比如針灸療法在腦出血治療的應(yīng)用已是非常廣泛，且已取得了相當(dāng)不錯(cuò)的效果，因而它已成為整個(gè)腦出血治療體系中尤其是康復(fù)過程中不可或缺的一部分內(nèi)容。如醒腦開竅針刺法或石氏中風(fēng)單元療法的應(yīng)用。有關(guān)腦出血分期的界定，一般劃分為4個(gè)階段：超急性期（發(fā)病后24 h之內(nèi)）、急性期（發(fā)病后48 h至7 d）、亞急性期（發(fā)病后8 d至4周）、慢性期（發(fā)病后>4周）。許多患者從腦出血發(fā)病之刻起到開始接受臨床診治之時(shí)已經(jīng)過了超急性期，所以急性期的診治顯得格外重要。本實(shí)驗(yàn)選擇較權(quán)威的醒腦開竅針刺法中的2個(gè)主穴：雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴、人中穴，共同發(fā)揮醒腦開竅，疏通經(jīng)絡(luò)的功效，以期為進(jìn)一步提高腦出血療效和腦出血患者的生命質(zhì)量，減輕患者家庭與社會(huì)的負(fù)擔(dān)做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用健康成年雄性Wistar大鼠135只，SPF級(jí)，體質(zhì)量215～245 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供。

1.1.2 毫針 不銹鋼毫針：蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 原位細(xì)胞檢測(cè)試劑盒：美國ROCHE公司（貨號(hào)：11684817910）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒：美國BD公司（貨號(hào)：556547）；流式細(xì)胞儀：美國BD公司accuri C6型。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和針刺組。針刺組和模型組又按照隨機(jī)數(shù)字表將其隨機(jī)各分為4個(gè)亞組，每亞組均為15只，共60只；假手術(shù)組為15只。實(shí)驗(yàn)過程中，共有10只大鼠因死亡而被剔除：假手術(shù)組1只；3 h模型組2只，9 h模型組1只，24 h模型組2只，48 h模型組2只；9 h針刺組1只，24 h針刺組1只。

采用Wistar大鼠尾狀核自體血緩慢注入法制作腦出血模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg），先使生理鹽水濕潤大鼠頭部?jī)啥g毛，后用刀片將其刮去。備皮后將大鼠以俯臥位固定在單臂腦立體定位儀上，參照《大鼠腦立體定位圖譜》[16]定位，前、后囟在同一水平面，然后將其門齒固定于門齒鉤上，同時(shí)調(diào)整好耳桿及儀器坐標(biāo)。頭部正中縱行切口，暴露前囟和冠狀縫，在冠狀縫前2 mm、中線右旁開4 mm處用直徑1 mm手鉆人工鉆開顱骨，將25 μL微量進(jìn)樣器針頭插在腦內(nèi)6 mm至尾狀核處，緩慢（5 min）注入25 μL自體全血（斷尾，輕輕捋尾，用抗凝管取血），留針5 min后退針。最后用無菌骨蠟封閉鉆孔并縫合頭皮，再用碘伏消毒液消毒創(chuàng)口。大鼠麻醉術(shù)后蘇醒，造模成功（預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Bederson評(píng)分法[17]和Longa評(píng)分法[18]評(píng)定行為學(xué)變化已經(jīng)證實(shí)），歸籠飼養(yǎng)。Bederson評(píng)分法：輕抓大鼠尾巴，提起大鼠高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直，0分：沒有神經(jīng)功能缺損；1分：腦部病變對(duì)側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2分：上述體征陽性，向麻痹側(cè)推阻力下降；3分：活動(dòng)時(shí)向麻痹側(cè)打圈（呈追尾狀）。Longa評(píng)分法：0分：沒有神經(jīng)功能缺損；1分：癱瘓側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)，大鼠向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)，大鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。評(píng)分在1分以上（包括1分）即為造模成功。模型組及針刺組復(fù)制腦出血模型，假手術(shù)組模擬手術(shù)創(chuàng)傷過程于尾狀核注入相同體積生理鹽水。

1.2.2 干預(yù)方法 針刺組于造模成功后3 h、9 h、24 h、48 h開始針刺，針刺2次/d（間隔6 h），連續(xù)針刺5 d后處死；模型對(duì)照組亦于造模成功后3 h、9 h、24 h、48 h開始模擬針刺組的捉抓過程，捉抓2次/d，連續(xù)捉抓5 d后處死；假手術(shù)組于手術(shù)后3 h開始模擬針刺組的捉抓過程，捉抓2次/d，連續(xù)捉抓5 d后處死。各組大鼠處死后立即斷頭取腦，觀察相應(yīng)指標(biāo)。

大鼠腧穴定位根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》，針刺組選取雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴、人中穴。針具選用31號(hào)、1.5寸不銹鋼毫針。內(nèi)關(guān)穴運(yùn)用透刺法，接電針治療儀，選用連續(xù)波，留針1 min；人中穴應(yīng)用雀啄法強(qiáng)行刺激10次，不留針。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 腦組織細(xì)胞凋亡率測(cè)定分別應(yīng)用TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，定量分析應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA），等級(jí)評(píng)估采用秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon）。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行表示。顯著性水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 若將組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，假手術(shù)組TUNEL陽性細(xì)胞率最低；與假手術(shù)組比較，同時(shí)間模型組和針刺組的TUNEL陽性細(xì)胞率明顯增高，尤其是同時(shí)間模型組增高最明顯，假手術(shù)組、同時(shí)間模型組、同時(shí)間針刺組3者比較，差別皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。針刺各亞組之間為48 h針刺組TUNEL陽性細(xì)胞率最高，與其余各亞組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；9 h針刺組較之24 h針刺組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而3 h針刺組分別較9 h針刺組及24 h針刺組的TUNEL陽性細(xì)胞率明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

在高倍鏡下，大鼠腦出血急性期血腫周圍腦組織TUNEL染色陽性細(xì)胞的胞核被染為棕褐色，且形態(tài)、大小各異，另有少量胞核被淡染為棕黃色，其以散在的形式不均勻地分布于正常細(xì)胞之間。假手術(shù)組偶見陽性細(xì)胞；模型各亞組陽性細(xì)胞顯著增多；針刺各亞組陽性細(xì)胞較假手術(shù)組仍增多，但較之對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型各亞組顯著減少。見圖2。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 假手術(shù)組細(xì)胞凋亡率最低；與其相比，同時(shí)間模型組的細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；相對(duì)而言，同時(shí)間針刺組的細(xì)胞凋亡率也較高，唯有24 h針刺組、48 h針刺組2者分別與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而3 h針刺組和9 h針刺組2者分別與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；針刺組各亞組與同時(shí)間模型組比較，細(xì)胞凋亡率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。針刺各亞組之間為24 h針刺組和48 h針刺組細(xì)胞凋亡率較高，但2者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），3 h針刺組和9 h針刺組細(xì)胞凋亡率較低，且2者分別與24 h針刺組、48 h針刺組比均，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），3 h針刺組、9 h針刺組2者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2、圖3、圖4。

3 討論

在腦出血發(fā)生后的急性期，腦細(xì)胞即會(huì)進(jìn)入細(xì)胞凋亡的起始階段，包括外始式和內(nèi)始式2種途徑[19]。現(xiàn)普遍認(rèn)為，外始式途徑又被稱為外源性死亡受體途徑，它始于腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）受體家族與配體的結(jié)合。當(dāng)腦組織缺血缺氧時(shí)，其相應(yīng)配體如凋亡相關(guān)因子配體（Fas ligand，F(xiàn)as-L）和TNF等皆上調(diào)[20]，引發(fā)半胱天冬酶原-8（Procaspase-8）通過高密度自催化激活自身產(chǎn)生半胱天冬酶-8（Caspase-8），后隨即誘導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21]。內(nèi)始式途徑亦被稱為內(nèi)源性線粒體途徑，它源于腫瘤抑制基因如p53，當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)會(huì)被激發(fā)，此時(shí)p53表達(dá)并誘發(fā)對(duì)細(xì)胞凋亡前產(chǎn)生作用的Bcl-2家族成員如Bax等的表達(dá)上調(diào)及Bcl-2等的表達(dá)下調(diào)，它們共同作用于細(xì)胞線粒體，導(dǎo)致線粒體內(nèi)外膜間物質(zhì)細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)[22]。繼而在細(xì)胞質(zhì)中由細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）及Procaspase-9共同組成的凋亡復(fù)合體形成，即Caspase-9的激活狀態(tài)，后誘導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23]。在細(xì)胞凋亡的效應(yīng)階段，Caspase-3等蛋白酶是整個(gè)過程的主要誘導(dǎo)物，它們受上一階段2種途徑已活化的Caspase-8或Caspase-9誘導(dǎo)激活，通過降解細(xì)胞骨架和DNA片段等方式最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[24]。

許多研究已證明，針刺對(duì)于細(xì)胞凋亡及其百分率具有良好的抑制作用。Feng R等[25]對(duì)電針應(yīng)用到缺血性腦卒中時(shí)所發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了綜述和總結(jié)，闡明電針能夠減少腦卒中后所帶來的腦損傷，同時(shí)可以在腦卒中未發(fā)病時(shí)誘導(dǎo)發(fā)生腦缺血耐受，而這些積極作用是通過促進(jìn)血管生成、減輕炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)BBB、抑制細(xì)胞凋亡等多方面機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。Hou X等[26]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從腦細(xì)胞凋亡角度探討了同時(shí)針刺百會(huì)穴與大椎穴對(duì)于海洛因復(fù)吸的影響，結(jié)果表明：經(jīng)過針刺干預(yù)后，所觀察的海馬和額葉區(qū)域病理損傷明顯減輕，同時(shí)Bcl-2表達(dá)上調(diào)、Bax表達(dá)下調(diào)，可見針刺發(fā)揮了類似西藥美沙酮的效果。由此得出結(jié)論，同時(shí)針刺百會(huì)穴與大椎穴可以預(yù)防海洛因復(fù)吸大鼠的腦細(xì)胞凋亡。李占標(biāo)等[27]觀察了針刺療法對(duì)局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）表達(dá)的影響，探討了針刺療法對(duì)局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刺能夠降低局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)的細(xì)胞凋亡率，提高大腦皮質(zhì)PKA陽性細(xì)胞表達(dá)率，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)與再生，從而降低神經(jīng)性為缺損評(píng)分，改善受損神經(jīng)功能。吳生兵等[28]研究并觀察了電針對(duì)腦心綜合征大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡和caspase-3表達(dá)的影響情況。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論：電針能夠有效地抑制腦心綜合征大鼠血腫周圍的腦細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能和下調(diào)病灶周圍Caspase-3的表達(dá)相關(guān)。

郭曉紅等[29]應(yīng)用Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法與TUNEL法2種方法對(duì)肝細(xì)胞的凋亡進(jìn)行了對(duì)比性研究，發(fā)現(xiàn)：前者的特異性高，而后者的靈敏度高，因此將二者結(jié)合起來檢測(cè)細(xì)胞凋亡更加準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)TUNEL結(jié)果證明，腦出血后的急性期，血腫周圍腦組織中凋亡細(xì)胞及其百分率顯著增高，經(jīng)增加針刺治療后，雖較假手術(shù)后同時(shí)間開始干預(yù)的凋亡細(xì)胞及其百分率仍偏高，但與腦出血急性期同時(shí)間即單行捉抓干預(yù)比較仍有明顯降低的趨勢(shì)，且腦出血3 h開始結(jié)合針刺治療的凋亡細(xì)胞及其百分率最低。流式細(xì)胞檢測(cè)也再一次地驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果：結(jié)合針刺后，細(xì)胞凋亡率與腦出血急性期同時(shí)間即單行捉抓干預(yù)比較有降低明顯，且腦出血3 h或9 h即開始配合針刺細(xì)胞凋亡率相對(duì)最低，療效幾近于假手術(shù)組。由此可見，該實(shí)驗(yàn)中TUNEL結(jié)果與流式細(xì)胞檢測(cè)基本一致。提示針刺治療能夠改善腦出血急性期所造成的血腫周圍腦組織相關(guān)的凋亡情況，從而在腦出血急性期起到保護(hù)腦組織的作用，且腦出血發(fā)生后針刺干預(yù)越早療效越好。

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