電針對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬P-糖蛋白和間質(zhì)液β淀粉樣蛋白水平的影響

周英奕 高譽(yù)珊 李麗娜 毛穎秋 張磊 張學(xué)婷 裴亞妮 薛衛(wèi)國

摘要 目的：通過觀察電針對(duì)于APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬P-糖蛋白表達(dá)和腦間質(zhì)液Aβ水平的影響，探討電針治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制。方法：12只4月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠，隨機(jī)分為電針組和模型組;6只4月齡雄性C57BL鼠為正常對(duì)照組。電針“百會(huì)”“涌泉”2周后，采用腦微透析檢測(cè)技術(shù)取小鼠腦間質(zhì)液，Elisa法檢測(cè)小鼠間質(zhì)液Aβ水平;免疫組化法觀察小鼠海馬P-糖蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組P-糖蛋白表達(dá)明顯減少;與模型組比較，電針組的表達(dá)相對(duì)增加。ELISA檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組的間質(zhì)液Aβ明顯減少;與模型組比較，針刺組Aβ水平明顯下降。結(jié)論：電針可以降低腦間質(zhì)液Aβ水平，并可以升高海馬內(nèi)P-糖蛋白的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 阿爾茨海默病;β淀粉樣蛋白;APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠;腦組織間液;P-糖蛋白;電針

Effects of Electroacupuncture at Baihui （DU 20） and Yongquan （KI 1） on P-glycoprotein

and Brain Interstitial Fluid β-amyloid in Hippocampus in APP/PS1 Transgenic Mice

Zhou Yingyi1， Gao Yushan2， Li Li′na2， Mao Yingqiu2， Zhang Lei1， Zhang Xueting1， Pei Yani1， Xue Weiguo1

（1 School of Acupuncture， Moxibustion and Tuina， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2 School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：To observe the effect of electroacupuncture on the level of P-glycoprotein and brain interstitial fluid Aβ in hippocampus in APP/PS1 transgenic mice， and to explore the mechanism of electroacupuncture in the treatment of Alzheimer′s disease. Methods：Twelve male APP/PS1 transgenic mice were divided into electroacupuncture group and model group randomly. Six male C57BL mice were used as normal control group. The level of Aβ in the interstitial fluid of mice was detected by Elisa method after two weeks of electroacupuncture at Baihui （DU 20） and Yongquan （KI 1）. The expression of P-glycoprotein in hippocampus was observed by immunohistochemistry. Results：Immunohistochemical results showed that the expression of P-glycoprotein was significantly decreased （P<0.01） in the model group when compared with the normal control group， and the expression of P-glycoprotein in the EA group was significantly increased （P<0.05） compared with the model group. ELISA test showed that the level of brain interstitial fluid Aβ in the model group was lower （P<0.01） than the level in the control group significantly. Compared with the model group， the level of Aβ in the acupuncture group was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion：Electroacupuncture can decrease the level of brain interstitial fluid Aβ and increase the expression of P-glycoprotein in hippocampus， which may explain why the EA have effects on AD.

Key Words Alzheimer′s disease; β-amyloid; APP/PS1 transgenic mice; Brain interstitial fluid; P-glycoprotein; Electroacupuncture

中圖分類號(hào)：R277.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.040

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s Disease，AD）是一種慢性進(jìn)行性疾病，是癡呆最常見的一種類型，主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、漸進(jìn)性記憶障礙等神經(jīng)精神癥狀。AD的主要病理特征是由β淀粉樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉積導(dǎo)致形成的老年斑塊（Senile Plaques，SP）堆積[1-2]。Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說是目前國際較為公認(rèn)的AD發(fā)病學(xué)說[3]，該學(xué)說認(rèn)為腦中Aβ的生成與清除失衡導(dǎo)致的沉積，是形成淀粉樣斑塊的原因[4]。

研究認(rèn)為Aβ在神經(jīng)元外的沉積對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生的損傷和破壞，是導(dǎo)致記憶AD病理改變的原因之一[5]。目前研究的靶點(diǎn)是通過降低腦內(nèi)Aβ水平，減輕其神經(jīng)毒性，緩解疾病進(jìn)程。腦中的Aβ主要分為可溶性和不可溶性2種形式。腦組織間液（Brain Interstitial Fluid，ISF）是一個(gè)中間過程，可溶性Aβ由此進(jìn)入不同代謝場所從而被進(jìn)一步清除，因此觀測(cè)ISFAβ的含量對(duì)于腦內(nèi)Aβ清除效果的評(píng)估具有重要意義[6]。腦內(nèi)Aβ清除主要通過血-腦屏障（Blood-brain Barrier，BBB）途徑轉(zhuǎn)運(yùn)，P-糖蛋白主要分布于P-糖蛋白主要分布在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BCECs）上，研究表明其是轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ外流出腦的重要載體，對(duì)Aβ水平的變化產(chǎn)生重要影響[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)選擇APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠，采用“益腎祛濁”法[9]，對(duì)“百會(huì)”“涌泉”兩穴進(jìn)行電針治療，觀察其對(duì)間質(zhì)液Aβ水平的影響;取樣海馬組織，觀察P-糖蛋白在該區(qū)域的表達(dá)，從而探討電針作用在AD疾病上的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 4月齡、雄性C57 BL鼠6只作為正常對(duì)照組;4月齡、雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠12只作為模型組和針刺干預(yù)組。動(dòng)物從南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所購入。

1.1.2 試劑與儀器 人Aβ42Elisa超敏試劑盒（美國，Life technologies公司，KHB3544）;P-糖蛋白兔單克隆抗體（美國，Abcam，ab170904），免疫組化超敏試劑盒（兔）（邁新生物科技，KIT-9706）;DAB顯色試劑盒（邁新生物科技，DAB-0031）;無菌針灸針（中研太和，0.25 mm×13 mm）;韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司，HANs LH202H型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 4月齡、雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠12只隨機(jī)等分為2組：電針觀察組（A）和模型組（M）;4月齡、雄性C57BL鼠6只作為正常對(duì)照組（C）。實(shí)驗(yàn)已被北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)通過。

1.2.2 針刺干預(yù)方法 電針觀察組的小鼠取俯臥位，使用自制鼠袋束縛，將其放置于治療臺(tái)上，根據(jù)大鼠針灸穴位圖譜以及比較解剖學(xué)的方法選穴定位，在頭頂正中取“百會(huì)”穴，平刺3～5 mm;在足底的前、中1/3交界處取“涌泉”穴，平刺5～7 mm。電針正、負(fù)極分別接左、右側(cè)“涌泉”穴，頻率為1/50 Hz，采用疏密波，強(qiáng)度約0.3 Ma。以動(dòng)物狀態(tài)穩(wěn)定、不劇烈掙扎嘶叫為度。治療的時(shí)間為15 min，隔日針刺，共2周。正常對(duì)照組、模型組僅不進(jìn)行針刺，其他條件均相同，用相同的自制鼠袋束縛，放置于治療臺(tái)上，束縛時(shí)間為15 min，隔日1次，共2周[10]。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 腦微透析取腦間質(zhì)液（ISF）及ELISA檢測(cè)? 麻醉小鼠后，進(jìn)行手術(shù)，將微透析探針放置于小鼠左側(cè)海馬C3區(qū)域處，探針（MAB公司，13.8.1）膜長為1 mm，膜截流分子量為10KD。夜間觀察小鼠的生命狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，于第2天將其送入CMA/120活動(dòng)裝置，小鼠可在清醒狀態(tài)下在裝置內(nèi)自由活動(dòng)，方便進(jìn)行長時(shí)間的微透析取樣，小鼠在運(yùn)動(dòng)過程中微透析探針?biāo)B接的細(xì)管不影響其活動(dòng)。探針與CMA微量取樣系統(tǒng)通過細(xì)管連接，內(nèi)外壓平衡1 h后，開始取樣腦間質(zhì)液[11]。CMA微量取樣系統(tǒng)采用0.5 μL/min的灌流速度，灌流替代液為不含蛋白的人工腦脊液，每隔1 h得到1管透析液樣品。每只小鼠取4管腦組織間液，第1 h樣品為平衡內(nèi)外壓時(shí)的取樣，故舍棄。

用人Aβ42Elisa試劑盒（美國，Life technologies公司，96T，KHB3544）檢測(cè)腦間質(zhì)液Aβ42的含量。提前配置好標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.13 pg/mL、1.56 pg/mL以及0 pg/mL（僅標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）;ELISA檢測(cè)板第一排每孔只放入濃度依次遞減的標(biāo)準(zhǔn)品25 μL和25 μL稀釋液覆膜封板，其余每排各孔均加入25 μL待測(cè)樣品和25 μL稀釋液覆膜封板，于室溫下靜置孵育3 h。用1X的洗滌緩沖液洗板4次。每孔加入100 μL二抗（空白對(duì)照的空孔除外），覆膜封板，于室溫下靜置孵育30 min。1X的洗滌緩沖液充分洗板4次。每孔加顯色劑100 μL，輕震混勻，室溫下避光孵育30 min。每孔加入100 μL的終止液。酶標(biāo)儀測(cè)吸光值，設(shè)定檢測(cè)波長為450 nm。用Excel軟件繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的曲線，根據(jù)計(jì)算出來的方程式計(jì)算樣品中Aβ42的濃度，再根據(jù)樣品稀釋情況換算海馬腦間質(zhì)液中Aβ42的濃度。

1.2.3.2 腦組織取樣及免疫組化 取小鼠右側(cè)半腦，放置于4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（PBS），固定7 d。自來水流水沖洗后修塊，用石蠟包埋，從視交叉處開始，于冠狀軸切片，厚度為6 μm，1只小鼠切10～15張片。選取海馬結(jié)構(gòu)完整且位于水平位的切片，進(jìn)行免疫組化ABC法[11]。

免疫組化法具體操作步驟：脫蠟（二甲苯15 min，2次;100%無水乙醇5 min，2次;95%、90%、80%、70%乙醇依次浸泡切片5 min，均1次）;枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原10 min;待恢復(fù)至室溫，PBS洗板3次;50 μL過氧化酶阻斷溶液（邁新生物科技，KIT-9706，A液）室溫孵育10 min;PBS洗板3次;山羊血清封閉液（邁新生物科技，KIT-9706，B液）孵育10 min;用濾紙吸干山羊血清，加兔抗鼠P-gp（美國，Abcam，ab170904）一抗以1：100稀釋，4 ℃孵育過夜;次日，PBS洗板5次，加入二抗（邁新生物科技，KIT-9706，C液）室溫孵育10 min，PBS洗板;再加入三抗（邁新生物科技，KIT-9706，D液）。PBS洗板3次，加入DAB顯色10 min;自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染40 s;自來水浸泡5 min，脫水（70%、80%、90%、95%乙醇各5 min浸泡清洗，100%無水乙醇清洗5 min，共2次;100%二甲苯10 min，共2次）、樹脂封片。使用DXM1200相機(jī)，用Leica系統(tǒng)連接并采集圖像。

使用Leica圖像采集系統(tǒng)，取每只小鼠的1張免疫組化染色后的切片，在400倍放大下，取小鼠海馬內(nèi)相同的3個(gè)視野拍照;采集圖片后，用Imagine Pro Plus（IPP）軟件算出每張圖片海馬區(qū)域內(nèi)P-糖蛋白的積分光密度（IOD）總和，取每只動(dòng)物所有圖片IOD的平均數(shù)，用此數(shù)據(jù)表示P糖蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件，對(duì)腦組織間液Aβ的ELISA檢測(cè)結(jié)果和海馬P-糖蛋白的免疫組化檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析。各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，故采用單因素方差A(yù)NOVA分析法;用LSD方法進(jìn)行兩兩比較，分析各組間數(shù)據(jù)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)間質(zhì)液Aβ水平 腦微透析取樣各組小鼠海馬腦間質(zhì)液，用ELISA法檢測(cè)其Aβ1-42水平。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，模型組高于正常對(duì)照組（P<0.01）;電針組低于模型組（P<0.01）。見表1。

表1 電針對(duì)于各組間質(zhì)液Aβ1-42水平的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01;與模型組比較，△△P<0.01

2.2 免疫組化法檢測(cè)P-糖蛋白 在海馬相同區(qū)域內(nèi)，觀察P-糖蛋白表達(dá)情況，3組均存在P-糖蛋白陽性表達(dá)，且均表達(dá)于微血管壁上。正常對(duì)照組陽性表達(dá)面積最大，且顏色較深;模型組陽性表達(dá)面積明顯減少，顏色也明顯變淺;與模型組比較，電針觀察組陽性表達(dá)面積有所增加。見圖1。采用IPP軟件對(duì)P-糖蛋白的陽性表達(dá)IOD值進(jìn)行半定量分析。兩兩比較可得，模型組海馬的P-糖蛋白IOD值大于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;電針觀察組海馬P-糖蛋白IOD大于模型組（P<0.05）。見表2。

圖1 小鼠海馬P-糖蛋白表達(dá)情況（免疫組化×400）

表2 各組小鼠海馬P-糖蛋白積分光密度（IOD）比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

3 討論

Aβ血管清除理論認(rèn)為腦內(nèi)Aβ的清除主要是通過BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的。Aβ經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)入血包括兩步，即分別透過腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BCECs）細(xì)胞膜的基底側(cè)和基頂側(cè)，且這兩步都需經(jīng)過特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)體或受體介導(dǎo)[12]。在BBB中，P-糖蛋白主要分布在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BCECs）與血液循環(huán)接觸的腔面上，也就是BCECs的基頂部位[13-14]，是Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)出腦的重要轉(zhuǎn)運(yùn)載體[15-16]。

腦組織間液（ISF）是Aβ進(jìn)入不同代謝途徑的中間場所。在AD發(fā)病的早期階段，腦組織中的Aβ大多存在于腦組織細(xì)胞間液（ISF），為可溶性形式，另一部分存在于腦組織中。隨著AD疾病的進(jìn)一步發(fā)展，可溶性Aβ經(jīng)由血管途徑的清除能力逐漸下降，逐漸在腦中聚集、變性成不溶性Aβ形式，進(jìn)一步沉積于腦血管壁形成腦血管淀粉樣變，這也是老年斑塊形成的主要原因。且研究表明，間質(zhì)液Aβ水平對(duì)AD的干預(yù)早期較晚期有更明顯的效果[17]。因此，選擇4月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠，排除了老年斑生成對(duì)于可溶性Aβ水平的影響，在前期觀察電針對(duì)于間質(zhì)液中可溶性Aβ水平的影響。近年來，越來越多的研究[18-19]采用腦微透析技術(shù)取樣，用于監(jiān)測(cè)腦內(nèi)Aβ水平的變化，其優(yōu)勢(shì)是可進(jìn)行在體、實(shí)時(shí)的取樣，且不干擾體內(nèi)的正常生命活動(dòng)[20]。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)分泌酶切割而生成的，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型就是轉(zhuǎn)入了過度表達(dá)的人類基因APP和早老素1（PS1），因此過度生成的APP蛋白和分泌酶（于PS1基因相關(guān)），使腦內(nèi)Aβ的生成增加。表1的結(jié)果也證實(shí)了相對(duì)于正常對(duì)照組，模型組的Aβ水平顯著增加，從而證實(shí)了APP/PS1模型選擇的正確性;Aβ的清除與其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力密切相關(guān)，因此通過對(duì)重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白水平的觀察，反映了APP/PS1鼠清除水平較C57BL鼠減低，從而導(dǎo)致老年斑塊的生成增多和出現(xiàn)的時(shí)間提前[21]，其神經(jīng)毒性繼而引發(fā)一系列病理變化。故該模型能較好地模擬AD發(fā)病。

中醫(yī)認(rèn)為AD的病位在腦，“血瘀痰阻”是其發(fā)病的主要病因病機(jī)。針刺“百會(huì)”“涌泉”2穴，上下相配，遠(yuǎn)近相應(yīng)，起到扶正固本、通絡(luò)祛濁的作用。通過對(duì)間質(zhì)液Aβ水平變化的觀察，實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因模型鼠海馬腦間質(zhì)液Aβ42水平大幅度增高，而電針能明顯降低腦間質(zhì)液Abeta42水平。其降低可能由于電針降低了Aβ42生成或增加了Aβ42的清除。電針后P-糖蛋白水平的提高，說明經(jīng)P-糖蛋白的腦微血管壁從腦間質(zhì)液向外周血液的Aβ42清除，可能在降低腦間質(zhì)液Aβ42水平中發(fā)揮一定的作用。

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