circRNA研究現(xiàn)狀及展望

王宏浩　韓文靜　張燕軍　蘇蕊　劉志紅　王瑞軍　王志英　趙艷紅　王志新　李金泉

摘要：circRNA（Circular RNAs）是一類不具有5末端帽子和3末端poly（A）尾巴并以共價鍵形成封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA（ncRNA）分子，根據(jù)circRNA的剪接來源不同，可分為外顯子circRNA（Exonic cirRNAs）、內(nèi)含子circRNA（cirRNAs）和外顯子一內(nèi)含子circRNA（Exon-in-troncircRNA，ElciRNA）。文章從分子特征、研究歷程、形成過程、作用機制及其數(shù)據(jù)庫及分析工具等方面對circRNA研究現(xiàn)狀和生物學功能進行綜述，結(jié)果顯示隨著高通量測序技術的進步和生物信息學的快速發(fā)展，越來越多的circRNA被挖掘，其具有穩(wěn)定性、廣泛性、保守性及組織特異性等性質(zhì)，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可作為一種疾病的生物標志物，在臨床診斷和治療方面具有廣闊的應用前景。但circRNA還有許多尚未知悉的重要生物學功能，如其在絨毛生長發(fā)育中的作用機理，且在疾病診斷和治療方面研究不夠深入。在今后研究中，應深入研究circRNA及其在疾病診斷、治療方面及絨毛發(fā)育的作用機制，充分了解其更多的生物學功能，使其廣泛應用于各研究領域。

關鍵詞：circRNA；特征；形成；生物學功能；作用機制

中圖分類號：S818.9 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）03-0431-09

0引言

人類基因組中可編碼蛋白質(zhì)的DNA僅為20%，其余均稱為非編碼RNA（Non-coding RNAs，ncRNAs），不被翻譯成蛋白質(zhì)，被認為是基因組的“暗物質(zhì)”（Pennisi，20 10），但并不表示其無遺傳信息或生物學功能（Mattick and Makunin，2006）。研究表明，ncRNAs參與細胞增殖、分化、凋亡、代謝、衰老等重要的生物學過程（Blaxter，2010；李靜秋等，2015），尤其是其參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（Memczak et a1.，2013）。自1990年人類基因組計劃被提出以來，ncRNAs逐漸被人們重視。根據(jù)ncRNAs結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為線形ncRNAs和環(huán)狀ncRNAs（Circular RNAs，circ-RNA）（Capel et a1.，1993）。但人們把更多的注意力聚焦在線性ncRNAs，尤其微小RNA（microRNA）和長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，IncRNA）的相關研究（Wang and Chang，2011；Qi et a1.，2013；王建勛等，2016），而鮮見circRNA的相關研究，主要原因是相對于大量的經(jīng)典線性ncRNAs，circRNA較罕見，曾被認為是錯誤剪接的副產(chǎn)物（Cocquerelle eta1.，1993；Benderdour et a1.，2002）。直到2015年An-dreeva和Cooper研究報道了circRNA廣泛存在于動植物細胞組織中，且具有很多特殊的生物學特性之后，才引起國內(nèi)外科學家的高度重視。目前circRNA還有許多尚未知悉的生物學功能，應加大研究力度，使其廣泛應用于各領域。

1circRNA的分子特征

circRNA有別于線形ncRNAs，是一類不具備5末端帽子和3末端poly（A）尾巴并以共價鍵形成封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性ncRNA分子，具有以下特征：

（1）circRNA廣泛存在于真核生物體的不同組織，如睪丸（Capel et a1.，1993）、大腦（Hansen et a1.，2011；Rybak-Wolf et a1.，2015；Hanan et a1.，2016）、胃（Chen et a1.，2016）、乳腺（Nair et a1.，2016）和前列腺等（Greene et a1.，2016），多數(shù)位于細胞質(zhì)，少數(shù)位于細胞核（Zhang et a1.，2013）。此外，circRNA在人體某些組織中的表達水平超過其線性異構(gòu)體的10倍（Julia et a1.，2012；Jeck et a1.，2013）。

（2）circRNA序列高度保守，但部分內(nèi)含子構(gòu)成的circRNA序列保守性不強（Jeck et a1.，2013）。

（3）circRNA的結(jié)構(gòu)有別于線形ncRNAs，對核酸酶不敏感，因此較線形ncRNAs更穩(wěn)定（Memczaket a1.，2013；肖時曦和王濤，2017）。

（4）大多數(shù)circRNA由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子組成，少數(shù)由內(nèi)含子或內(nèi)含子片段直接環(huán)化形成（戰(zhàn)昊等，2016）。

（5）circRNA具有microRNA應答元件（micro-RNA response element，MRE），可作為競爭性內(nèi)源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA），與mi-croRNA結(jié)合，在細胞中發(fā)揮microRNA海綿效應（microRNA sponge），強烈抑制microRNA活性，導致靶基因表達水平增加（Hansen et a1.，2013a；玄麗佳和孫亞男，2016）。

（6）雖然circRNA不翻譯成蛋白質(zhì)，但可作為蛋白質(zhì)的合成模板（Wang and Wang，2014），已有研究證實，大量circRNA可作為信使RNA（mRNA）來編碼蛋白（Hsiao et a1.，2017；Yang et a1.，2017）。

（7）多數(shù)circRNA在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用，少數(shù)只能在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控作用（Zhang et a1.，2013）。

2drcRNA的研究歷程

1976年Sanger等在研究馬鈴薯紡錘塊莖病中發(fā)現(xiàn)了可致病的單鏈環(huán)狀類病毒。這是人類第一次發(fā)現(xiàn)circRNA。1979年Hsu和Cocaprados用電子顯微鏡觀察到circRNA存在于真核細胞細胞質(zhì)。1980年Amberg等在酵母線粒體中發(fā)現(xiàn)了circRNA。1993年Capel等在小鼠睪丸決定性別基因（Sex-determiningregion Y，Sry）中發(fā)現(xiàn)有circRNA轉(zhuǎn)錄。1993年Coc-querelle等在人體細胞中發(fā)現(xiàn)circRNA。201 1年Danan等研究發(fā)現(xiàn)，circRNA普遍存在于古生菌細胞中。Jeck等（2013）在人類成纖維細胞中檢測出25000多種circRNA。2013年Memczak等結(jié)合人白細胞數(shù)據(jù)庫，從RNA-Seq數(shù)據(jù)中鑒定出人類circRNA 1950種、小鼠circRNA 1903種（其中與人類circRNA相同的有81種）和線蟲circRNA 724種。在今后研究中，科學家應借助高通量測序技術和生物信息學技術，對circ-RNA展開系統(tǒng)深入的研究。

3drl2RNA的形成過程

目前，人們普遍熟知從mRNA前體（pre-mRNA）到線形ncRNAs的轉(zhuǎn)錄過程，但事實上pre-mRNA還可被非線性地反向剪接成circRNA（Memczak et a1.，2013）。circRNA的形成取決于順式作用元件（Cis-acting element）和反式作用因子（Trans-act factor）。circRNA選擇性環(huán)化機制分為三類，其模型（Qu eta1.，2015）如圖1所示?；蚪M同一位置可轉(zhuǎn)錄出mRNA和circRNA，通過內(nèi)含子序列問競爭性互補配對形成外顯子circRNA（Exonic cirRNAs）、內(nèi)含子circRNA（cirRNAs）和外顯子一內(nèi)含子circRNA（EX-on-in-troncircRNA，EIciRNA）3類circRNA分子（Quet a1.，2015）。這些circRNA分子問存在競爭性平衡關系，可影響mRNA的表達。該選擇性環(huán)化機制非常復雜，可能需要一些因子參與調(diào)控，如RBPs等（chen and Yang，2015）。其中外顯子circRNA的形成機制又分為兩種，其模型（Jeck et a1.，2013）如圖2所示。模型1為套索驅(qū)動環(huán)化（Lariat-driven circula-rization），外顯子跳躍形成套索結(jié)構(gòu)促進環(huán)化，隨后剪掉內(nèi)含子形成circRNA（Jeck et a1.，2013）。模型2為內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化（Intron-pairing-driven circu-larization），不需要外顯子跳躍，而是通過兩側(cè)內(nèi)含子上的反向互補序列堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，隨后剪掉內(nèi)含子，最終形成circRNA（Jeck et a1.，2013；閆寧寧等，2015）。

3.1剪接體促進circRNA形成

circRNA是剪接體通過非經(jīng)典剪接方式對pre-mRNA進行反向剪接而形成，其中剪接體主要是由蛋白質(zhì)和小分子核RNA（snRNA）組成，是一個龐大、復雜的動態(tài)分子機器，在circRNA形成過程中發(fā)揮重要作用。外顯子circRNA形成的兩種模型不同之處在于第一步形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)機制，即套索驅(qū)動的環(huán)化是由外顯子組成的剪接供體和剪接受體共價結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化則是2個內(nèi)含子互補配對結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Jeck et a1.，2013）。但也有研究表明，circRNA表達并不總是與同源基因所產(chǎn)生的線形ncRNAs表達相關，說明剪接體能區(qū)分前向剪接（Forword splicing）（Jeck et a1.，2013）和后向剪接（Back splicing）（Starke et a1.，2015），但目前對剪接體區(qū)分機制尚不清楚。

3.2順式作用元件促進circRNA形成

已有研究證實，不同順式內(nèi)含子互補配對序列的競爭性配對可導致circRNA可變反向，從而使一個基因位點產(chǎn)生多個circRNA，表明順式元件一內(nèi)含子互補配對序列對circRNA表達發(fā)揮重要作用（zhanget a1.，2014；Zhang et a1.，2016）。

3.3反式作用因子調(diào)控circRNA形成

3.3.1盲?。∕uscleblind，MBL）調(diào)控circRNA形成 盲肌是一種RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding pro-tein，RBP）。pre-mRNA兩側(cè)的內(nèi)含子上均有MBL結(jié)合位點，可特異性結(jié)合MBL（Ashwal-Fluss et a1.，2014）。這些結(jié)合位點的存在表明一些MBL亞型可能促進circRNA產(chǎn)生。因此，MBL是參與調(diào)控circ-RNA合成的生物因子（玄麗佳和孫亞男，2016）。

3.3.2選擇性剪接因子QKI參與circRNA形成 前人研究表明，在人類上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial tomesenchymal transition，EMT）過程中超過33%的circ-RNA受選擇性剪接因子Qrd的動態(tài)調(diào)節(jié)（Conn eta1.，2015），如圖3所示。在EMT過程中，Qrd通過結(jié)合pre-mRNA上的特定結(jié)合位點，促進circRNA形成，Qrd表達量越高，circRNA數(shù)目越多?？梢?，上皮細胞中高效表達QKI會促進circRNA的形成。

3.3.3 RNA編輯修飾酶ADARl抑制circRNA形成 ADARl不僅能編輯修飾RNA，還可作為雙鏈RNA結(jié)合蛋白。因此，ADARl可通過干擾RNA配對抑制circRNA形成，從而使circRNA數(shù)量減少（chen andYang，2015；chen，2016），表明cicrRNA形成與RNA編輯修飾酶ADARl表達呈負相關。

4circRNA作用機制

4.1circRNA發(fā)揮microRNA海綿效應

circRNA具有許多的生物學特性，但相關研究主要集中在其與microRNA調(diào)控機制上。前人研究表明，富含microRNA結(jié)合位點的circRNA是microRNA的海綿吸附體，可抑制microRNA與靶基因結(jié)合，從而發(fā)揮microRNA海綿效應，提高靶基因的表達水平，是一類高效率的ceRNA（李禎祺等，2015；Liu et a1.，2016）。目前，研究最多的是ciRS-7，其作為miR-7的海綿吸附體，通過募集miR-7間接調(diào)控多種癌相關信號轉(zhuǎn)導通路中主要的致癌基因表達下調(diào)（李培飛等，2014；戰(zhàn)昊等，2016），從而發(fā)揮抑癌作用。Jens（2013）研究發(fā)現(xiàn)，小腦退行性相關蛋白基因1（CDR，）的circRNA分子（cDRlas-ciRS-7）廣泛存在于人和小鼠的大腦，包含73個保守的miR-7靶位點，從而抑制miR-7與靶基因CDRI的結(jié)合，發(fā)揮microRNA海綿效應?？梢姡攎icroRNA與對應的mRNA結(jié)合時可阻止蛋白質(zhì)生成，而microRNA被circRNA吸附時，mRNA翻譯合成蛋白質(zhì)（肖時曦和王濤，2017）。

4.2 circRNA的生物合成過程影響基因剪接

已有研究證實，真核細胞circRNA是通過反向剪接pre-mRNA而形成（Chen，2016）。由此推測剪接pre-mRNA的方式有3種：第一種是通過經(jīng)典剪接生成線性mRNA；第二種是反向剪接和經(jīng)典剪接相結(jié)合生成circRNA；第三種是反向剪接、經(jīng)典剪接和選擇性剪接相結(jié)合對線性mRNA進行剪接（chen eta1.，2015）。Chen（2016）研究發(fā)現(xiàn)，雖然circRNA表達水平較低，但可通過不同途徑影響基因表達，而有效擴展真核細胞轉(zhuǎn)錄組的多樣性和復雜性。

4.3circRNA調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄

circRNA可參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如來源于錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域52（ANKRD52）基因二號內(nèi)含子區(qū)域的circRNA（ciRNA derived from intron ofANKRD52，ci-ankrd52）能產(chǎn)生錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域，通過反義寡核苷酸（Antisense oligo deoxynucleotide，ASO）封閉ci-ankrd52的表達，致使ANKRD52 mRNA的表達量顯著減少（Zhang et a1.，2013）。另外，含內(nèi)含子序列的circRNA常位于細胞核內(nèi)，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，ci-ankrd52主要于細胞核中積累，可促進RNAPolII對ANKRD52基因的轉(zhuǎn)錄（chen，2016）。

4.4circRNA調(diào)控基因表達

ElciEIF3J是由真核翻譯延長因子3J（EW3J）產(chǎn)生的一種含內(nèi)含子的circRNA，與U1 snRNP和EIF3J啟動子共同促進EIF3J轉(zhuǎn)錄（Li et a1.，2015b）。此外，ElciRNAs的發(fā)現(xiàn)暗示circRNA的種類及功能具有多樣性，證實了circRNA在細胞核中調(diào)控基因表達的重要功能，并揭示了ElciRNA與U1 snRNA相互作用的調(diào)控機制（Li et a1.，2016）。

4.5circRNA抑制翻譯

人抗原R（Human antigen R，HuR）是一種RNA結(jié)合蛋白，通過結(jié)合多種RNA調(diào)控蛋白表達模式（Brennan and Steitz，2001）。Abdelmohsen等（2017）從Hela細胞中分離出與HuR相互作用的circRNA，其中以hsa circ 0031288的變化最明顯，與其對應是poly（A）結(jié)合蛋白核1[poly（A）-binding protein nu-clear 1，PABPN1]基因的mRNA前體（circPABPNl），其功能不受HuR影響，但大量的circPABPNl會競爭性結(jié)合HuR，阻止HuR結(jié)合至PABPNl的線性ncRNAs上，從而降低PABPN1 mRNA的翻譯效率（圖4）。

4.6circRNA為疾病的生物標志物

circRNA作為microRNA的海綿吸附體，可間接調(diào)控microRNA靶基因表達，在人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用（Garzon et a1.，2009；Hansen eta1.，2013b；任顯顯等，2016）。因此，circRNA可作為疾病的生物標志物，廣泛用于疾病診斷。Ahmed等（2016）對3例IIIc期病人的原發(fā)部位、腹膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進行了RNA雙端測序（Paired-end RNA se-quencing），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高度異質(zhì)性癌癥轉(zhuǎn)錄組中，circRNA表達具有一致性，最適合作為卵巢癌的生物標志物，為該癥治療及預后提供新的候選標志。Floris等（2016）利用Arraystar Human circRNA探針（含有13617個人類circRNA）和qRT-PCR技術篩選差異表達的circRNA，并檢測抗抑郁治療4周和8周后的circRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅1個circRNA（hsa circ103636）表達量在抑郁癥患者治療8周后顯著下調(diào)，表明hsa circ 103636與抑郁癥的疾病進程有關，可用作重度抑郁癥患者診斷與治療的潛在的新生物標志物（Cui et a1.，2016）。Shang等（2016）檢測了肝癌變組織中3個circRNA（hsa circ 0000520、hsa circ0005075和hsa circ 0066444）的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa circ 0005075是一個潛在的肝癌標志物，但尚不清楚hsa circ 0005075及其他circRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。circRNA在心血管疾病和胃癌診斷中也發(fā)揮重要作用，如hsa circ 0124644可用于冠狀動脈疾病的診斷（zhao et a1.，2017），hsa circ002059、hsa circ 0000096和hsa circ 0000190可作為胃癌診斷標志物（Li et a1.，2015a；Chen et a1.，2017；Li et a1.，2017）。此外，動脈粥樣硬化（Burd eta1.，2010）、病毒性肝炎（Taylor，1991）等疾病均與circ-RNA有關。

5circRNA數(shù)據(jù)庫及分析工具

隨著高通量測序技術和生物信息學技術的不斷發(fā)展，circRNA的研究越來越深入，不同種類的circRNA被發(fā)現(xiàn)，相關數(shù)據(jù)庫和分析工具也相繼推出。目前，廣泛使用的數(shù)據(jù)庫包括deepBase數(shù)據(jù)庫（http：//deepbase.sysu.edu.cn/）、microRNA-circRNA相互作用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫circRNABase（http：//starbase.sysu.edu.cn/mirCircRNA.php）（Li et a1.，2013；Li eta1.，2014）、circBase數(shù)據(jù)庫（http：//www，circbase.org/）、Circ2Traits功能數(shù)據(jù)庫（http：//gyanxet—beta.com/circdb/）、CircRNADb數(shù)據(jù)庫（http：//reprod.nimu.edu.cn/circmadb）等。其中，deepBase數(shù)據(jù)庫包含大約人類、鼠等不同物種的15萬個circRNA數(shù)據(jù)；circ-Base數(shù)據(jù)庫包含大量已知或未知功能的circRNA數(shù)據(jù)，不但可準確地找到某個circRNA的成熟體序列，還能查詢某基因能產(chǎn)生circRNA的個數(shù)及其表達豐度；CircRNADb數(shù)據(jù)庫是首個匯總可編碼蛋白的circ-RNA的數(shù)據(jù)庫（Chen et a1.，2016）。HppRNA（https：//sourceforge.net/projiects/hppma/）是一種新開發(fā)的RNA—Seq數(shù)據(jù)分析工具（Huang et a1.，2015；Wang，2017），包含pre—mapping、sequence variation detec-tion等模塊，可滿足大樣本系統(tǒng)性分析的需求?？梢?，這些數(shù)據(jù)庫和分析工具的推出為深入挖掘當前大數(shù)據(jù)提供了便利，但仍需通過試驗對其預測分析結(jié)果進行驗證。

6展望

circRNA在各領域的研究如雨后春筍。目前人們對circRNA的形成和特征已基本了解，但仍有許多生物學功能尚不清楚。有關circRNA的研究主要集中在其與疾病問的相關性方面，大量研究表明，circ-RNA可作為疾病的生物標志物，在癌癥治療及預后方面存在巨大的發(fā)展?jié)摿?，但對各種疾病的發(fā)生發(fā)展調(diào)控機制知之甚少，需進行深入探究?，F(xiàn)已研究證實，在動物體內(nèi)microRNA通過與靶mRNA的3端非翻譯區(qū)結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄后的翻譯，從而發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用（Doench et a1.，2003）。付紹印等（2012）研究表明，microRNA靶基因指紋圖譜（Mi—croRNA targets fingerprint，MTFP）經(jīng)濟適用、操作性強，可用于探索microRNA調(diào)節(jié)的靶基因或評估靶基因的表達譜特征。馬繼登（2014）研究發(fā)現(xiàn)，豬體內(nèi)circRNA可能同樣發(fā)揮著microRNA海綿吸附體的作用，間接調(diào)控豬的生理代謝。VenO等（2015）運用高通量測序技術從豬胚胎腦組織中鑒定出4634個circRNA，其在豬胚胎腦組織發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。隨著高通量技術的發(fā)展，越來越多與絨毛生長發(fā)育相關的miRNA及其靶基因被發(fā)掘鑒定。劉洋（2016）對絨山羊胎兒期毛囊發(fā)育相關xnicroRNA進行篩選和鑒定，結(jié)果顯示，oar-let-7和oar-miR-200家族的microRNA在妊娠45 d顯著上調(diào)，表明其可能在毛囊發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用。因此，基于circRNA、microRNA和mRNA問的關系，可推測有一些circ-RNA也參與調(diào)控絨毛生長發(fā)育。但其在絨毛生長發(fā)育中的作用機理未見報道。circRNA還有許多尚未知悉的重要生物學功能，其在各研究領域均具有巨大的應用潛力。

（責任編輯 陳燕）