刺絡瀉血療法對四氯化碳誘導的HF大鼠PCⅢ、CⅣ的影響

張博 趙慧玲 譚麗 魏珂 魏丹蕾 曾蕊

摘要目的：本實驗采用用四氯化碳（CCL4）誘導的SD大鼠HF模型，在大鼠足三里、太沖、陽陵泉這3個穴位上進行刺絡瀉血治療，觀察該療法對HF模型大鼠肝臟組織形態(tài)、肝功能AST、ALT及肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ的影響，從而探索刺血療法對于HF的療效及其作用機制。方法：SpragueDawley（SD）大鼠40只，雄性，隨機分為4組，空白對照組（10只）、模型對照組（10只）、秋水仙堿組（10只）以及刺血干預組（10只）。除空白對照組外，其余3組用40% CCL4（花生油稀釋）誘導HF模型，為期6周。第6周至第12周，對空白對照組的大鼠09%生理鹽水皮下注射，2次/周，至12周；其余3組的大鼠持續(xù)注射40% CCL4（花生油稀釋），模型對照組的大鼠只抓取，不做其他處理，秋水仙堿組同時220 μg/（kg·d）標準給予秋水仙堿，5次/周；刺絡瀉血組同時進行刺絡瀉血療法干預，2次/周，至12周。12周后，麻醉大鼠并行開腹術，取大鼠肝左葉小塊組織行石蠟包埋、切片，以及Masson染色，觀察大鼠肝左葉的組織形態(tài)學改變；采用ELisa法對肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ，采用化學法對肝功能指標AST、ALT進行定量檢測。結果：1）肝臟組織形態(tài)改變：對切片分析后可見生理鹽水對照組肝小葉結構完整，匯管區(qū)周圍存在少量染色；模型組肝小葉消失，纖維架橋出現(xiàn)，形成肝纖維化；秋水仙堿組和刺血干預組肝纖維化程度明顯比造模組減輕，但比空白對照組嚴重，說明秋水仙堿組和刺血干預組干預均有效。2）肝功能情況：比較于模型對照組，刺血干預組AST、ALT含量顯著降低（P<005），秋水仙堿組AST含量降低（P>005），而ALT含量顯著降低（P<005）；提示刺血療法可顯著降低血清AST、ALT的含量。3）對肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ的影響：比較于模型對照組，秋水仙堿組和刺血干預組PCⅢ、CⅣ的含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）提示刺血療法可以顯著降低PCⅢ、CⅣ的含量。

關鍵詞肝纖維化；刺絡瀉血；Ⅲ型前膠原；Ⅳ型膠原

Effects of Pricking Blood Therapy on PC III and C IV in HF Rats Induced by Carbon Tetrachloride

Zhang Bo1， Zhao Huiling1， Tan Li2， Wei Ke3， Wei Danlei1， Zeng Rui1

（1 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2 Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou

510405， China； 3 Beijing Fengtai Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine， Beijing 100071， China）

AbstractObjective：To observed effect of the pathological change of the liver， liver function and apoptosis factor PCIII and PCIV in HF model rats induced by CCL4， and with the treatment on or near Taichong， Zusanl and Yanglingquan of the rats by pricking blood therapy with a threeedged needle， so as to explore the mechanism of bloodletting in prevention and treatment of HF rats. Methods：Forty male SD rats were randomly divided into normal control group， model group， colchicinescontrolled group and bloodletting group with 10 cases in each group. Except the normal control group， the other three groups were induced into liver fibrosis model with 40% CCL4 diluted by peanut oil. After 6 weeks， the colchicinescontrolled group was given colchicine 200 μg/（kg·d） with 5 times a week； the bloodletting group had 0.150.2 mL hemorrhage on or near Taichong， Zusanl and Yanglingquan with 2 times a week. After 12 weeks， the general conditions of rats were observed； Small piece of liver tissue selected from left lobe of liver was embedded in paraffin， sliced and stained with Masson and its pathological changes were observed； The liver function AST， ALT were detected by ELISA method； PCⅢ and PCIV were detected by the expression by fluorescence semi quantitative PCR. Results：The morphological change of liver tissue：Masson staining showed structural integrity of hepatic lobule. There were only a little collagen fibers in portal area. Compared with normal group， masson staining result indicated significant liver fibrillation. The fibrillation of colchicinescontrolled group and bloodletting group was lighter than that in model group， indicating the treatment was effective. Liver function：compared with the model group， AST， ALT levels of the pricking blood group decreased significantly （P<005）， and AST content of colchicine control group decreased （P>005）. And the content of ALT significantly reduced （P<005）； Pricking blood therapy could significantly reduce the serum AST and ALT levels； PCIII， CIV expression：compared with the model group， PC III， C IV expression of colchicine group and thorn blood group decreased， and the difference had statistical significance （P<005）. The pricking blood therapy can significantly down regulated the expression of PCIII and CIV. Conclusion：Firstly， bloodletting therapy can reduce the content of serum ALT and AST to a certain extent， and can protect liver function. Secondly， bloodletting therapy can significantly reduce the expression of PCIII and CIV. Thirdly， bloodletting therapy is effective in the treatment of liver fibrosis in rats， which can reduce the expression of apoptosis inhibiting gene PCIII and CIV， as well as change the ratio of PCIII/CIV.

Key WordsHepatic fibrosis； Blood pricking therapy； PCⅢ； CⅣ

中圖分類號：R24531+2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.043

肝纖維化（Hepatic Fibrosis）是慢性肝病向肝硬變以及肝癌的發(fā)展必經(jīng)階段，在肝纖維化發(fā)展的后期會嚴重影響患者的生命質量，如果繼續(xù)惡化，甚至危及生命。我國長期以來都占據(jù)著肝病大國的位置，根據(jù)2008年調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，全球大約有35億乙肝病毒感染者，中國大約有12億，占總數(shù)的343%，占我國人口總數(shù)的98%[1]。慢性乙型肝炎發(fā)展為肝纖維化，只需要2～6年的時間，慢性乙型肝炎患者中約10%～15%的人可能會在5～10年內(nèi)發(fā)展為肝纖維化，從而導致肝硬化。此外，急性丙肝的危害也較大，2007年世界衛(wèi)生組織公布數(shù)據(jù)表明，全球約有17億人感染丙型肝炎病毒，包括肝硬化或肝癌；我國HCV的感染率約為32%[2]。2009年報告的發(fā)病人數(shù)在短短6年時間內(nèi)竟然達到是2003年發(fā)病人數(shù)的6倍多。多項研究表明，肝纖維化經(jīng)過治療后可以發(fā)生逆轉化。因此，提早預防和干預肝纖維化的形成，對各種慢性肝病的治療具有重要意義?，F(xiàn)代醫(yī)學治療肝纖維化的手段，主要從肝纖維化發(fā)生的各個途徑抑制纖維化的發(fā)生和發(fā)展，但是在治療肝纖維化的過程中，不僅需要長期服藥，而且會有較大經(jīng)濟負擔，因此，有必要尋求一種更為安全有效、經(jīng)濟、無不良反應的治療方法。

1材料與方法

11材料

111動物清潔級健康雄性SD大鼠44只，體重（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）20120001。在2級動物室（北京中醫(yī)藥大學實驗針灸動物室：室溫22 ℃，相對濕度45%）清潔條件下喂養(yǎng)。

112藥物四氯化碳（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，生產(chǎn)批號：20130326）；秋水仙堿（國藥集團化學試劑有限公司，生產(chǎn)批號：4415010150）；花生油（魯花集團有限公司，生產(chǎn)批號：691616861630）。

113試劑與儀器甲醛溶液（分析純，北京鼎國昌盛生物技術有限公司，生產(chǎn)批號：20130907）；磷酸氫二鈉（北京鼎國昌盛生物技術有限公司，生產(chǎn)批號：20140310）；磷酸氫二鈉（北京鼎國昌盛生物技術有限公司，生產(chǎn)批號：20140310）；10%水合氯醛（北京中醫(yī)藥大學生理教研室配制）；75%酒精（北京夢怡美商貿(mào)中心）；09%氯化鈉溶液（江蘇強生生物科技有限公司）；試劑盒：ALT、AST生化試劑盒，由北京中醫(yī)藥大學科研中心提供；離心機（3K18 Sigma）；全自動生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S220）；Imagepro Plus 6圖像分析系統(tǒng)（北京中醫(yī)藥大學科研中心提供）；Anymicro DSSTM圖像采集系統(tǒng)（北京中醫(yī)藥大學科研中心提供）；電子秤（HOCKY AD05）；小號三棱針（北京中研太和醫(yī)藥有限公司20 mm×57 mm）；移液槍（北京中醫(yī)藥大學針灸推拿機能實驗室提供）。

12實驗方法

121分組與模型制備采用隨機數(shù)字表法將44只大鼠隨機分為2組，空白組12只，模型組32只。參考王偉明[3]、周賢[4]的造模方法，即在大鼠頸后皮下注射經(jīng)過花生油稀釋的40% CCL4。使用該造模方法對36只大鼠造模。6周后隨機選取2只模型組大鼠，2只空白組大鼠進行肝臟病理切片觀察，以保證造模成功。最終納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計的是空白組10只，模型組30只。然后將模型組大鼠隨機分為模型對照組，刺血干預組及秋水仙堿組，每組10只。

122干預方法全部大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，空白組：常規(guī)飼養(yǎng)，09%生理鹽水皮下注射，2次/周，至12周，第6周后只抓取，其他不做任何處理；模型對照組：皮下注射經(jīng)過花生油稀釋的40% CCL4 6周，2次/周，第6周后只抓取，不做其他處理，至12周；刺血干預組：皮下注射經(jīng)過花生油稀釋的40%CCL4 6周，2次/周，同時足三里、陽陵泉、太沖刺血，出血量為025～04 mL（換算公式為出血量=體重×74%×2%）[510]，2次/周，至12周；秋水仙堿組：皮下注射經(jīng)過花生油稀釋的40% CCL4 6周，2次/周，同時220 μg/（kg·d）標準給予秋水仙堿[11]，5次/周，至12周。

123檢測指標與方法實驗進行至第12周末，各組大鼠禁食不禁水12 h，使用10%水合氯醛（35 mL/kg）進行腹腔注射麻醉后，固定于鼠板，開腹后于腹主動脈取血5 mL，靜置2 h，在4 ℃環(huán)境下，將離心機設置3 000 r/min，離心20 min，分離上層血清，移液槍轉移血清至EP管，-80 ℃保存，待用于ALT、AST、PCⅢ、CⅣ的檢測；選取肝左葉距邊緣約05 cm處取1 cm×1 cm×05 cm大小新鮮肝組織，投入10%中性甲醛溶液中固定，用石蠟包埋后切片，使用MASSON法染色。

13統(tǒng)計學方法采用SPSS 220統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較中，若各組方差齊且數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時用單因素方差分析檢驗，組間比較用LSD及SNK檢驗，方差不齊或非正態(tài)時用Welch檢驗或Nemenyi非參數(shù)檢驗；方差齊時進行2組獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用非參數(shù)檢驗。以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

21各組大鼠肝臟組織鏡下形態(tài)學變化Masson染色可直接顯示除各組大鼠肝組織的匯管區(qū)周圍纖維增生的情況，可直觀的判斷除正常組之外的各組大鼠HF的程度和范圍。根據(jù)以上Masson染色片可知，正常組大鼠的肝小葉結構完整，僅在匯管區(qū)周圍有少許膠原纖維被染色；模型組大鼠肝小葉結構消失，匯管區(qū)周圍纖維架橋形成，HF明顯，這就說明造模成功；與模型組比較，秋水仙堿對照組和刺血干預組大鼠的HF程度明顯減輕，但比正常對照組的HF程度嚴重這說明2組的治療均有效。見圖1。

22刺絡瀉血療法對各組大鼠肝功能ALT、AST的影響造模結束后，與生理鹽水對照組同時間比較，模型組的AST、ALT含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；與模型組同時間比較，刺血干預組AST、ALT含量顯著降低（P<005），秋水仙堿對照組AST含量降低（P>005），而ALT含量顯著降低（P<005）；刺血干預組與秋水仙堿對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005）。見表1。

23刺絡瀉血療法對各組大鼠肝纖維化指標PCⅢ、ⅣC的影響造模結束后，與生理鹽水對照組同時間比較，模型組的PCⅢ、ⅣC含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；與模型組同時間比較，刺血干預組PCⅢ、ⅣC含量顯著降低（P<005），秋水仙堿對照組PCⅢ、ⅣC含量顯著降低（P<005）但刺血干預組與秋水仙堿對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005）。見表2。

圖1大鼠肝臟病理形態(tài)學改變（Masson×400）

表1各組大鼠AST、ALT含量的比較（±s，U/mL，n=10）組別ASTALT空白對照組1615±3382059±608模型對照組2992±542*3306±669*刺血干預組2428±388△2735±53△秋水仙堿組234±4843034±421△注：與正常組同時間點比較，*P<005；與模型組同時間點比較，△P<005

表2各組大鼠PCⅢ、ⅣC的比較（±s，U/mL，n=10）組別PCIIIPCIV空白對照組6586±2646461±1478模型對照組12276±601*9715±2515*刺血干預組8267±2857△4978±1133△秋水仙堿組8370±2762△4846±1574△注：與正常組同時間點比較，*P<005；與模型組同時間點比較，△P<005

3討論

目前，國內(nèi)外臨床診斷HF的“金標準”是肝活檢組織病理學檢查，指通過肝穿刺取出少量的肝組織進行組織切片，鏡下觀察以明確診斷肝纖維化，同時可以估測肝纖維化的炎癥活動度、纖維化程度以及藥物療效。但是每次肝穿刺取出的肝組織體積僅占全部肝肝組織的1/50 000，而肝纖維化在肝內(nèi)發(fā)生的部位不同，因此一次肝穿刺具有偶然性不穩(wěn)定性，并從而造成誤診因此強調(diào)肝活檢時要有以下2個標準：首先，肝臟組織穿刺標本的直徑至少要達到15 mm；其次，肝臟組織穿刺取出的標本要包含6個以上的匯管區(qū)，且Bedossa[12]建議肝穿刺獲得肝組織時要不應少于25 mm。

本實驗對不同組別的大鼠的Masson染色切片觀察和分析得知，刺絡瀉血療法有效地減輕了四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠模型的肝臟組織形態(tài)學改變的程度。Masson染色切片，模型對照組大鼠的肝臟組織學形態(tài)改變明顯，已經(jīng)形成了肝纖維化；模型對照組大鼠的肝小葉結構消失，并在匯管區(qū)周圍形成纖維架橋。將刺絡瀉血組和秋水仙堿組與模型對照組的Masson染色切片比較可見，刺絡瀉血組和秋水仙堿組大鼠的肝臟病變程度明顯減輕。秋水仙堿是目前治療肝纖維化的有效藥物之一，以此作為對照，可以間接證明刺絡瀉血療法能夠有效治療肝纖維化。

31刺絡瀉血對PCⅢ、CⅣ的影響本實驗的研究結果表明，刺絡瀉血療法可以有效降低PCⅢ、CⅣ在肝臟組織中的表達，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。刺絡瀉血療法能有效降低CCL4誘導肝纖維化大鼠PCⅢ、CⅣ的含量，其效果與西藥秋水仙堿作用相當，改善肝纖大鼠肝組織病理變化，減輕肝損傷。

32刺絡瀉血對肝功能指標AST、ALT的影響AST、ALT的血清活性是最常使用的反映肝細胞損傷的敏感指標。當肝細胞嚴重病變、壞死時，線粒體內(nèi)釋放出AST；當肝細胞變性細胞膜變性、細胞膜通透性增加時，從細胞內(nèi)逸出的主要是ALT[13]；在本實驗研究中，刺血干預組能夠降低AST、ALT的含量，減輕肝損傷與秋水仙堿組比較雖無明顯差異，但效果最優(yōu)。

目前，肝纖維化的發(fā)病機制已經(jīng)非常明確，即肝組織中大量沉積無法代謝的膠原纖維，導致肝細胞轉變?yōu)槔w維細胞。肝纖維化是各種慢性肝病以及病毒性肝炎和酒精性肝病等重大疾病向肝硬化甚至肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段。目前，各種研究已經(jīng)表明肝纖維化經(jīng)過適當?shù)闹委熀笫峭耆梢园l(fā)生逆轉。因此，抑制肝臟纖維化的發(fā)展，具有重大的現(xiàn)實意義。

近年來，西醫(yī)的抗肝纖維化藥物已達到細胞分子水平，也有的藥物可以通過基因調(diào)控肝細胞內(nèi)信息的表達，從而在一定程度上治療肝纖維化。同時，中醫(yī)藥在抗纖維化的研究中發(fā)揮了重要的作用，大量的中藥抗纖維化實驗和臨床研究為抗纖維化提供了寶貴的經(jīng)驗，顯示出其獨特的優(yōu)越性。

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明刺絡瀉血療法可調(diào)節(jié)血液循環(huán)，加快人體新陳代謝，可刺激骨髓的造血功能，增多循環(huán)血液中的紅細胞數(shù)量，提升血液含氧量刺血療法還可以通過神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，改善局部微循環(huán)，加快代謝排出血中毒害物質的能力，進而提高人體的免疫能力?，F(xiàn)代研究表明[14]，刺絡瀉血療法可以明顯改善血管內(nèi)血液的流變狀態(tài)以及增強體內(nèi)循環(huán)供血的能力，可以調(diào)節(jié)人體的凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)，進而起到調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。國外研究發(fā)現(xiàn)[15]，在治療遺傳性血色沉著病時，運用刺絡瀉血療法可以間接的改善患者的HF程度，因此，可以推斷刺絡瀉血療法可能是通過綜合調(diào)整人體的供血功能以及內(nèi)分泌功能從而達到有效治療甚至逆轉HF的功能。但是，根據(jù)目前的情況來看，我們?nèi)耘f需要加大對刺絡瀉血療法的研究，以期進一步探明刺絡瀉血療法治療HF的內(nèi)在機制以及對于HF不同程度的干預效果。只有更多的研究和更多的探索，才能進一步為臨床治療HF提供實驗基礎，為探索刺絡瀉血療法對于HF的治療機理具有重大意義。

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