從白星花金龜中提取甲殼素的工藝研究

李小萬　王萍莉

摘要目的：探討從白星花金龜中提取甲殼素的最佳制備工藝。方法：選取白星花金龜?shù)某上x為原料，采用強(qiáng)酸強(qiáng)堿對成蟲粉進(jìn)行脫除無機(jī)鹽和蛋白質(zhì)處理，再脫色后得到甲殼素，用干法灰分法和紫外吸收法分別測定提取物中殘余的無機(jī)鹽和蛋白質(zhì)。結(jié)果：用15 g/L檸檬酸溶液在室溫下按料液比1∶10浸泡白星花金龜成蟲粉26 h，脫無機(jī)鹽效果較好；用10%氫氧化鈉溶液按料液比為1∶10在80 ℃水浴條件下處理提取物45 h，脫蛋白質(zhì)的效果較好；用10%H2O2溶液按料液比為1∶12在60 ℃水浴浸泡3 h脫色，可制得白色粉狀甲殼素，得率為283%。結(jié)論：該提取工藝簡便可行，獲得的甲殼素得率高，性狀良好，殘余蛋白質(zhì)和灰分含量較低。

關(guān)鍵詞白星花金龜；甲殼素；脫除無機(jī)鹽；脫除；蛋白質(zhì)

Study on the Extraction of Chitin from Protaetia Brevitarsis Lewis

Li Xiaowan， Wang Pingli

（Xinjiang Agricultural Vocational and Technical College Biological Technology Branch， Changji 831100， China）

AbstractObjective：To study the best preparation process of chitin extraction from protaetia brevitarsis， Lewis. Methods：The adult larvae of the white star flower are used as raw materials， and the adult powder and protein are removed by strong acids and alkalis. The chitin is obtained after decolorization. The residual inorganic salts and protein in the extract are determined by dry ash method and ultraviolet absorption method. Results：15 g/L citric acid solution was used to soak adult protaetia brevitarsis， Lewis powder at a ratio of 1∶10 at room temperature for 26 h， and the effect of removing inorganic salts was better； 10% NaOH solution was used to the ratio of material to liquid was 1∶10， and the extract was processed at 80 ℃ water bath for 45 h. The effect of deproteinization was better. The white powdery chitin was obtained by using 10% H2O2 solution at a ratio of 1∶12 in a water bath at 60 ℃ for 3 h. The yield rate was 283%. Conclusion：The extraction process is simple and feasible， and the obtained chitin has high yield， good traits and low residual protein and ash content.

Key WordsProtaetia brevitarsis Lewis； Chitin； Removal of inorganic salts； Removal of protein

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.049

甲殼素又稱甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，屬于氨基多糖，被譽(yù)為“人類第六生命要素”，是自然界中一種帶正電荷的天然高分子材料，因具有良好的吸濕性、生物降解性、無不良反應(yīng)以及不污染環(huán)境等諸多優(yōu)良特性，近幾年被廣泛應(yīng)用在環(huán)保工業(yè)、紡織工業(yè)、醫(yī)藥保健行業(yè)、食品工業(yè)、農(nóng)林業(yè)等方面[15]。

甲殼素廣泛存在于低等植物菌類、藻類的細(xì)胞，節(jié)肢動物蝦、蟹、蠅蛆和昆蟲的外殼，高等植物的細(xì)胞壁中[6]。因來源不同，其甲殼素的含量也不同。據(jù)報道：蝦殼中含量為20%～25%，蟹殼中的含量為15%～18%，昆蟲原表皮層中的含量為25%～60%[7]等。

目前市場上的甲殼素獲得主要是以蝦殼和蟹殼為原料來提取制備。以蝦蟹為原料，資源成本高，且甲殼素含量低、灰分含量高，提取物中的重金屬難以脫除，同時其生產(chǎn)受到地域性和季節(jié)性的限制較大[811]，因此，尋找及開發(fā)新的甲殼素資源具有重要意義。據(jù)報道，白星花金龜蟲體中甲殼素含量達(dá)233%[12]。因其作為害蟲在農(nóng)田中分布廣泛[13]，比較容易獲得，且相關(guān)的研究報道較少，故我們以白星花金龜為研究對象，主要研究從其成蟲體中提取甲殼素的一種酸堿法的優(yōu)化工藝，旨在為獲取新的甲殼素資源提供參考。

1材料

11試藥

白星花金龜成蟲：采自新疆昌吉市周邊鄉(xiāng)鎮(zhèn)；檸檬酸：食品級，鄭州中天實驗儀器有限公司，生產(chǎn)批號：160508；氫氧化鈉：分析純，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：160316；過氧化氫，草酸，高錳酸鉀，乙醇，碘碘化鉀，濃硫酸，以上試劑均為分析純。

12儀器

LD800型實驗室超微粉碎機(jī)，長沙常宏制藥設(shè)備廠；DK98I型恒溫水浴鍋，泰斯特儀器有限公司；1012型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SXL1208馬沸爐，上海精宏干燥箱廠；UV2450型紫外分光光度計，日本島津公司；BS2000S型電子天平，北京賽多利斯儀器廠等。

2方法

21工藝流程

白星花金龜成蟲→預(yù)處理（悶死、清洗、烘干、粉碎）→脫無機(jī)鹽→水洗至中性→脫蛋白質(zhì)→水洗至中性→脫色→烘干→甲殼素。

22指標(biāo)分析檢測

221定性分析1）顯色反應(yīng)：取少量提取物倒入小培養(yǎng)皿中，并用鑷子將其依次移人含量為95%、70%、50%、30%乙醇溶液中清洗，再用蒸餾水沖洗待用；將甲殼素置于自瓷點滴試驗板上，加入1滴003%碘碘化鉀溶液，再加1滴1%H2SO4在點滴試樣板上，顯示紫褐色，再加數(shù)滴75%H2SO4紫色逐漸消失，表明測定物為甲殼素。2）α一萘酚實驗：取少量提取物溶于水中，然后再加98%濃硫酸，振搖，在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現(xiàn)了紅紫色的環(huán)（紫環(huán)反應(yīng)），表明了該提取物為甲殼素[14]。

222定量分析1）灰分測定：采用干法灰分法，按以下公式計算各實驗組的的灰分含量，以確定脫除無機(jī)鹽最佳試驗條件；總灰分（%）=（恒重后坩堝和灰分質(zhì)量-恒重后坩堝質(zhì)量）/樣品質(zhì)量×100[15]；2）殘余蛋白質(zhì)含量測定：采用紫外吸收法，采用以下公式計算各實驗組的蛋白質(zhì)含量，以確定脫除蛋白質(zhì)的最佳試驗條件。蛋白質(zhì)含量（μg/mL）=（145A280-074A260）×稀釋倍數(shù)，式中：A280、A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280 nm、260 nm處測得的吸光度[16]。

23預(yù)處理

231悶死挑選大小一致的白星花金龜成蟲，裝入塑料薄膜袋內(nèi)密封至悶死不動。

232清洗用水反復(fù)沖洗至表面無明顯污漬，瀝干。

233烘干放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，于75 ℃烘至白星花金龜蟲體硬脆。

234粉碎用小型粉碎機(jī)粉碎，過20目篩，得白星花金龜蟲粉，裝袋密封備用。

24脫無機(jī)鹽

241檸檬酸濃度對脫無機(jī)鹽效果的影響稱取5份白星花金龜蟲粉，5 g/份，分別置于100 mL三角瓶中，按1∶10（g/mL）的固液比分別加入濃度為09、12、15、18、21（g/L）檸檬酸溶液，在室溫條件下反應(yīng)26 h后，離心并將固體產(chǎn)物水洗至中性，干燥后得脫無機(jī)鹽的各組樣品，分別測定各組樣品灰分，以確定檸檬酸的最適濃度。

242檸檬酸作用時間對脫無機(jī)鹽效果的影響稱取5份白星花金龜蟲粉，5 g/份，分別置于100 mL三角瓶中，在檸檬酸濃度15 g/L、固液比1∶10（g/mL）、室溫條件下，分別作用18 h、22 h、26 h、30 h、34 h后，離心并將固體產(chǎn)物水洗至中性，干燥后得脫無機(jī)鹽的各組樣品，分別測定各組樣品灰分，以確定檸檬酸作用的最適時間。

243檸檬酸酸浸料液比對脫無機(jī)鹽效果的影響稱取5份白星花金龜蟲粉，5 g/份，分別置于100 mL三角瓶中，在檸檬酸濃度15 g/L、室溫條件下，分別按固液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）加入檸檬酸溶液，反應(yīng)時間26 h，離心并將固體產(chǎn)物水洗至中性，干燥得脫無機(jī)鹽的各組樣品，分別測定各組樣品灰分，以確定檸檬酸的最適固液比。

25脫蛋白質(zhì)處理

251氫氧化鈉濃度對脫蛋白質(zhì)效果的影響取脫無機(jī)鹽最佳條件下所得的濾渣5份，分別置于250 mL三角瓶中，按固液比1∶10（g/mL），分別加入6%、8%、10%、12%、14%氫氧化鈉溶液，在80 ℃水浴鍋中作用5 h，離心并將固體產(chǎn)物水洗至中性，干燥得脫蛋白質(zhì)的各組樣品，分別測定各組樣品殘余蛋白質(zhì)含量，以確定氫氧化鈉的最適濃度。

252氫氧化鈉作用時間對脫蛋白質(zhì)效果的影響取脫無機(jī)鹽最佳條件下所得的濾渣5份，分別置于250 mL三角瓶中，在固液比1∶10（g/mL）、氫氧化鈉濃度10%的條件下，在80 ℃水浴鍋中分別作用1 h、3 h、5 h、7 h、9 h，離心并將固體產(chǎn)物水洗至中性，干燥得脫蛋白質(zhì)的各組樣品，分別測定各組樣品殘余蛋白質(zhì)含量，以確定氫氧化鈉作用的最適時間。

253氫氧化鈉堿浸溫度對脫蛋白質(zhì)效果的影響取脫無機(jī)鹽最佳條件下所得的濾渣5份，分別置于250 mL三角瓶中，在固液比1∶10（g/mL）、氫氧化鈉濃度10%條件下，分別置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴鍋中，恒溫作用5 h，離心并將固體產(chǎn)物水洗至中性，干燥得脫蛋白質(zhì)的各組樣品，分別測定各組樣品殘余蛋白質(zhì)含量，以確定氫氧化鈉作用的最適溫度。

254氫氧化鈉堿浸固液比的確定取脫無機(jī)鹽最佳條件下所得的濾渣5份，分別置于250 mL三角瓶中，按固液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）分別加入10%氫氧化鈉溶液，在90 ℃水浴鍋中恒溫作用5 h，離心并將固體產(chǎn)物水洗至中性，干燥得脫蛋白質(zhì)的各組樣品，分別測定各組樣品殘余蛋白質(zhì)含量，以確定氫氧化鈉作用的最適固液比。

26脫色處理

取脫無機(jī)鹽和脫蛋白質(zhì)最佳條件處理后的樣品3份，以料液比1∶12（g/mL），分別加入3%高錳酸鉀、3%草酸和10%H2O2，在60 ℃水浴浸泡3 h，水洗，于110 ℃烘箱烘干，觀察甲殼素的性狀[17]。

27甲殼素的質(zhì)量

取白星花金龜成蟲按以上的最佳實驗條件進(jìn)行甲殼素提取，并對提取物進(jìn)行定性和定量分析。

3結(jié)果

31脫無機(jī)鹽處理

311檸檬酸濃度對脫無機(jī)鹽效果的影響

樣品中灰分含量隨著檸檬酸濃度的增加，總體呈下降趨勢。但當(dāng)檸檬酸濃度小于15 g/L，曲線下降較快，當(dāng)檸檬酸濃度大于15 g/L時，曲線趨于平緩，所以脫無機(jī)鹽效果最佳的檸檬酸濃度為15 g/L。見圖1。

312檸檬酸作用時間對脫除無機(jī)鹽效果的影響

隨著檸檬酸作用時間的延長，灰分含量呈下降趨勢，在反應(yīng)的最初階段，曲線下降較快，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到26 h以后其灰分含量的下降趨勢明顯減緩。26 h為脫除無機(jī)鹽效果最佳的檸檬酸作用時間。見圖2。

313酸浸料液比對脫除無機(jī)鹽效果的影響當(dāng)固液比由1∶6（g/mL）變至1∶10（g/mL）時，灰分含量下降趨勢較為明顯，而當(dāng)固液比由1∶10（g/mL）變至1∶14（g/mL）時，曲線下降趨勢不明顯。1∶10（g/mL）為脫除無機(jī)鹽效果最佳的酸浸料液比。見圖3。

32脫蛋白質(zhì)處理

321氫氧化鈉濃度對脫蛋白質(zhì)效果的影響當(dāng)氫氧化鈉濃度由6%增至10%時，殘余蛋白質(zhì)的含量下降較明顯，但當(dāng)氫氧化鈉濃度大于10%時，殘余蛋白質(zhì)含量下降的趨勢平緩，對脫除蛋白質(zhì)的影響效果不是很大。10%為脫蛋白質(zhì)效果最佳的氫氧化鈉濃度。見圖4。

322氫氧化鈉作用時間對脫蛋白質(zhì)效果的影響隨著氫氧化鈉的作用時間的延長，殘余蛋白質(zhì)含量下降較快，但當(dāng)氫氧化鈉浸泡時間超過45 h時，曲線趨于平緩，45 h是脫蛋白質(zhì)效果最佳的氫氧化鈉作用時間。見圖5。

323氫氧化鈉堿浸溫度對脫蛋白質(zhì)效果的影響氫氧化鈉堿煮的溫度越高，脫除蛋白效果越明顯，但當(dāng)達(dá)到80 ℃以后，殘余蛋白質(zhì)含量下降的趨勢減緩。80 ℃是脫除蛋白質(zhì)效果最佳的氫氧化鈉堿煮溫度。見圖6。

324氫氧化鈉堿浸固液比對脫蛋白質(zhì)效果的影響當(dāng)固液比1∶6（g/mL）變至1∶10（g/mL）時，曲線下降較快，說明脫除蛋白質(zhì)的效果明顯；但當(dāng)固液比超過1∶10（g/mL）以上時，曲線平緩，說明對除蛋白的效果不明顯，因此，確定1∶10（g/mL）為脫除蛋白質(zhì)的效果最佳的堿浸固液比。見圖7。

33脫色處理

通過3種脫色劑的相同條件處理，只有10%過氧化氫脫色所得的甲殼素顏色最純，所以10%過氧化氫為最佳脫色劑。見表1。

34甲殼素的質(zhì)量

341定性分析結(jié)果均呈陽性，表明所獲提取物為甲殼素。

342從白星花金龜成蟲中獲得的甲殼素收率較高，且殘余蛋白質(zhì)和灰分較低。其中殘余灰分為125%，低于2%。見表2。

4討論

在借鑒前人研究成果的基礎(chǔ)上，經(jīng)過預(yù)試驗篩選，選擇了檸檬酸、氫氧化鈉、過氧化氫等試劑對白星花金龜進(jìn)行脫無機(jī)鹽、脫蛋白質(zhì)、脫色處理，以測定提取物中殘余的灰分含量、殘余的蛋白質(zhì)含量、觀察甲殼素的性狀為質(zhì)量指標(biāo)，最終確定了從白星花金龜成蟲中提取甲殼素的最佳工藝條件為：在白星花金龜蟲粉中以1∶10的料液比，加入15 g/L檸檬酸溶液在室溫下浸泡26 h，進(jìn)行脫無機(jī)鹽處理；再以1∶10的料液比，加入10%NaOH溶液在80 ℃水浴條件下處理45 h，進(jìn)行脫蛋白質(zhì)處理；再以1∶12的料液比，加入10%H2O2溶液在60 ℃水浴浸泡3 h，水洗，烘干后得到了白色粉狀甲殼素，得率為283%。可以替代蝦蟹殼作為新的甲殼素提取原料。

在本研究的預(yù)試驗中，分別以白星花金龜?shù)?種不同蟲態(tài)（成蟲，幼蟲，蛹，成蟲鞘翅）作為原料，經(jīng)過提取分析后，發(fā)現(xiàn)白星花金龜成蟲中的甲殼素得率最高，其次是成蟲鞘翅、再次是蛹、最后是幼蟲。這說明甲殼素含量多少與昆蟲體壁的角質(zhì)化程度大小相關(guān)。因為甲殼素主要存在于昆蟲的體壁的表皮層部分，所以在提取時應(yīng)選擇體壁中角質(zhì)化較高且大小均一的白星花金龜作為原料。

甲殼素的定性分析應(yīng)該用紅外光譜法，但因為試驗儀器故障問題，本試驗選用了傳統(tǒng)的顯色反應(yīng)來鑒別，結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定的影響，在后續(xù)研究中需改進(jìn)。

灰分含量是衡量甲殼素質(zhì)量的主要指標(biāo)之一，本試驗中所獲甲殼素中殘余灰分雖然降到了2%以下，但只達(dá)到了工業(yè)級的甲殼素標(biāo)準(zhǔn)[18]，而未達(dá)到食品級的甲殼素標(biāo)準(zhǔn)（<1%）。原因可能與用檸檬酸代替了鹽酸作為除無機(jī)鹽的試劑有關(guān)。

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（2016-10-09收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）