人參皂苷20（sRg3對(duì)llcpk1細(xì)胞中順鉑所致腎毒性的保護(hù)作用

吳勝斌　王應(yīng)燈

摘要目的：探討人參皂苷20（s）Rg3對(duì)llcpk1細(xì)胞中順鉑所致腎毒性的保護(hù)作用。方法：通過基于細(xì)胞的腎臟保護(hù)試驗(yàn)，研究了發(fā)酵黑參（FBG）及其活性成分人參皂苷20（S）Rg3對(duì)豬腎（LLCPK1）細(xì)胞中順鉑（化療藥物）誘導(dǎo)的損傷的保護(hù)作用。結(jié)果：由順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低，再使用FBG提取物和人參皂苷20（S）Rg3依賴劑量后明顯恢復(fù)。用FBG提取物或人參皂苷20（S）Rg3處理后會(huì)降低順鉑誘導(dǎo)升高與磷酸化cJun N末端激酶（JNK），p53和裂解的半胱天冬酶3升高的蛋白。通過用FBG和人參皂苷20（S）Rg3的共同處理，由于順鉑的誘導(dǎo)導(dǎo)致凋亡LLCPK1細(xì)胞升高的百分比顯著降低。結(jié)論：人參皂苷20（s）Rg3可改善LLCPK1的細(xì)胞毒性，人參皂苷20（S）RG3可能是通過阻斷JNKP53caspase3信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來介導(dǎo)這種作用的重要組成部分。

關(guān)鍵詞順鉑；人參皂苷20（S）Rg3；llcpk1細(xì)胞；cJun N末端激酶；腎毒性；發(fā)酵黑參；絲裂原活化蛋白激酶；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；磷酸脫氫酶；甘油醛3磷酸脫氫酶

Protective Effects of Ginsenoside 20 （s）Rg3 on Renal Toxicity Induced by Cisplatin in llcpk1 Cells

Wu Shengbin， Wang Yingdeng

（Department of Nephrology， the Ninth People′s Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200011， China）

AbstractObjective：To discuss protective effects of ginsenoside 20 （s）Rg3 on renal toxicity induced by cisplatin in llcpk1 cells. Methods：The protective effect of fermented black ginseng （FBG） and its active ingredient ginsenoside 20 （S） Rg3 on cisplatin induced damage induced by cisplatin （chemotherapeutic drugs） in pig kidney （LLCPK1） cells was studied by cell based renal protection test.This article studied the protective effect of fermentation of black ginseng cells （FBG） and its active component ginsenoside 20 （S）Rg3 on porcine kidney （LLCPK1） cells in cisplatin （chemotherapy）induced injury based on kidney protection test. Results：The cisplatin induced cell viability decreased， and then FBG was used to extract and ginsenoside 20 （S）Rg3 was restored by FBG. After the dose dependent or extract ginsenoside 20 （S） afterRg3 treatment may reduce cisplatin induced increased phosphorylation of cJun and Nterminal kinase （JNK）， p53 and caspase cleavage the increase of3 protein. By using FBG and 20 ginsenosides （S） together withRg3， the percentage of cisplatin induced apoptosis in LLCPK1 cells leaded to increased significantly. Conclusion：FBG and its major ginsenoside 20（S）Rg3， ameliorated cisplatininduced nephrotoxicity in LLCPK1 cells by blocking the JNKep53ecaspase3 signaling cascade.

Key WordsCisplatin； Ginsenoside 20 （S）Rg3； llcpk1 cell； cJun Nterminal kinase； Nephrotoxicity； FBG； MAPK； ERK； Phosphate dehydrogenase； Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.045

人參是最著名的中草藥之一，其個(gè)體成分可增強(qiáng)腎功能[1]。人參通過減弱氧化應(yīng)激有效地改善了大鼠鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的腎功能障礙[24]。最近，評(píng)價(jià)人參引起的藥物腎毒性的作用，以及參與這一反應(yīng)的機(jī)制和活性成分，還有人參潛在的腎臟保護(hù)功效成為人們感興趣的研究領(lǐng)域[57]。人參可防止大鼠慶大霉素（一種氨基糖苷類抗生素）引起的腎損傷[1]。慶大霉素誘導(dǎo)的腎毒性與氧化損傷有關(guān)。與人參共同施用，通過抑制自由基形成和抗氧化系統(tǒng)的恢復(fù)來減少慶大霉素誘導(dǎo)的腎損傷。在人參的幾個(gè)成分中，酚酸、黃酮，負(fù)責(zé)增加腎血流量和消除自由基，表現(xiàn)出對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的氧化毒性的保護(hù)作用[811]。

目前對(duì)開發(fā)方法已經(jīng)進(jìn)行了研究，可使用熱加工來提高人參轉(zhuǎn)換為達(dá)瑪烷型皂苷的藥理功效。按照這個(gè)概念，已經(jīng)準(zhǔn)備了黑參作為原料人參來進(jìn)行熱加工和發(fā)酵。雖然一些對(duì)于人參的研究集中在其對(duì)糖尿病的保護(hù)作用[3]，但還不清楚黑參對(duì)藥物誘導(dǎo)的腎毒性的影響。

本研究旨在研究黑參及其活性成分人參皂苷20（S）Rg3對(duì)豬腎（LLCPK1）細(xì)胞中順鉑（化療藥物）誘導(dǎo)的損傷的腎臟保護(hù)作用。此外，我們著重評(píng)估絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作為黑參在腎臟保護(hù)作用中的重要影響。

1材料與方法

11材料

111細(xì)胞

豬腎（LLCPK1）細(xì)胞（美國，美國典型培養(yǎng)物保藏中心）。

112藥物

人參皂苷20（S）Rg3（中國，長(zhǎng)春市凱瑞化學(xué)試劑經(jīng)銷站）；順鉑（美國，美國Sigma公司）。

113試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（美國，美國Sigma公司）；胎牛血清（美國，Thermo公司）；p38促分裂素原活化蛋白激酶試劑盒（美國，美國Sigma公司）；EzCytox試劑（美國，美國Sigma公司）；磷酸化p38試劑盒，p44/42（美國，美國Abcam公司）促分裂素原活化蛋白激酶細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶試劑盒（美國，美國Abcam公司）；放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液（美國，美國Sigma公司）；磷酸化p44/42，cJunN末端激酶試劑盒（JNK）（美國，美國Abcam公司）；化學(xué)發(fā)光預(yù)先蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑（美國，美國R&D公司）；Tali凋亡試劑盒（美國，美國Invitrogen公司）；磷酸化末端激酶試劑盒（美國，美國Abcam公司）；p53，裂解的半胱天冬酶3試劑盒（美國，美國Abcam公司）；甘油醛3磷酸脫氫酶試劑盒（GAPDH）（美國，美國Abcam公司）和辣根過氧化物酶綴合的抗兔抗體試劑盒（美國，美國Abcam公司）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國，Thermo公司）；酶標(biāo)儀（美國，BioRad公司）；凝膠成像儀（美國，BioRad公司）；Tali圖像的細(xì)胞儀（美國，Thermo公司）；Fusion Solo化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（法國，法國VILBER公司）。

12方法

121分組與模型制備

人參干粉提取物由北京同仁堂吉林人參有限責(zé)任公司提供。四年生白參是從大連富生制藥有限公司購買的。人參的真實(shí)性是根據(jù)成分配方確定的。黑參在85 ℃下通過9個(gè)循環(huán)反復(fù)蒸煮白參8 h并在50 ℃下干燥48 h制備。為了制備人參提取物，將黑參粉碎成粉末，并用10倍體積的蒸餾水，在80 ℃ 72 h萃取1次，然后過濾并冷卻。人參提取物用酵母菌（丹麥格林納拉勒曼德）在34 ℃下發(fā)酵25 h。發(fā)酵后，將黑參提取物在85 ℃滅菌22 h，然后凍干。本研究中使用的黑參提取物中的人參皂苷Rg2，Rg3，Rh1，Rh2和Rf分別為286 mg/mL，2452 mg/mL，1262 mg/mL，063 mg/mL和132 mg/mL[12]。

122檢測(cè)指標(biāo)與方法

評(píng)估對(duì)順鉑所致腎細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：使用LLCPK1細(xì)胞評(píng)估對(duì)抗氧化腎細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[1213]。LLCPK1細(xì)胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心購買，并在空氣中含5%的CO2和37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和4 mmol/L L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基。將每空1×10個(gè)細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，并使其粘附2 h。然后，將試驗(yàn)樣品、自由基供體25 μmol/L順鉑或兩者均加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24 h后，除去含有測(cè)試樣品、自由基供體或兩者的培養(yǎng)基。在37 ℃將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基（90 mL/孔）和EzCytox試劑（10 mL/孔）中培養(yǎng)2 h。通過使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度來測(cè)定細(xì)胞活力。

蛋白印跡分析：全細(xì)胞提取物制備按照制造商的說明使用放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液，以1 mmol/L苯甲基磺酰氟作為輔助。蛋白質(zhì)（全細(xì)胞提取物，20 mg/泳道）在預(yù)制415迷你PROTEAN TGX凝膠電泳分離后涂抹到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并利用表位特異性原發(fā)性和繼發(fā)性抗體進(jìn)行分析。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光預(yù)先蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑和Fusion Solo化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)以顯現(xiàn)結(jié)合的抗體。

基于圖像的流式細(xì)胞儀測(cè)定：LLCPK1細(xì)胞用于基于圖像的凋亡測(cè)定系統(tǒng)。所有測(cè)定均按照用于操作Tali圖像的細(xì)胞儀的指南進(jìn)行。細(xì)胞在37 ℃，5%CO2的環(huán)境下用樣品處理24 h。使用TrypLE試劑通過胰蛋白酶處理后收獲細(xì)胞，并使用Tali凋亡試劑盒進(jìn)行染色。對(duì)樣本進(jìn)行獨(dú)立劃分和分析并按照制造商推薦的協(xié)議使用Tali圖像和流動(dòng)細(xì)胞儀廠家。通過用膜聯(lián)蛋白VAlexa Fluor 488綴合物染色測(cè)定細(xì)胞群的凋亡部分。碘化丙啶（PI）用于從凋亡細(xì)胞（Annexin V陽性/PI陰性）分化死細(xì)胞（膜聯(lián)蛋白V陽性/PI陽性或膜聯(lián)蛋白V陰性/PI陽性）。由Tali式細(xì)胞儀測(cè)出存活的、凋亡的和死亡的細(xì)胞群的百分比與來自同一樣品獨(dú)立運(yùn)行的流式細(xì)胞儀上的數(shù)據(jù)是類似的[1415]。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 200統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用多重比較檢驗(yàn)和方差分析。以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

在本研究中，我們?cè)噲D確定黑參提取物及其活性人參皂苷20（S）Rg3的腎臟保護(hù)作用以及所涉及的機(jī)制，以確定其治療潛力。我們進(jìn)行了基于細(xì)胞的腎臟保護(hù)試驗(yàn)，以評(píng)估黑參提取物和人參皂苷20（S）Rg3對(duì)LLCPK1細(xì)胞的保護(hù)作用。使用LLCPK1細(xì)胞系建立腎細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)條件，該細(xì)胞系通常用于評(píng)估腎毒性[1617]。用25 μmol/L的順鉑治療后，控制LLCPK1細(xì)胞存活率降低到60%。使用黑參及人參皂苷20（S）RG3后，由順鉑導(dǎo)致降低得細(xì)胞存活率明顯恢復(fù)（圖1）。黑參提取物和人參皂苷20（S）Rg3分別控制在500 mg/mL和250 mg/mL水平改善了順鉑導(dǎo)致的腎毒性。

正常的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的失調(diào)與急性與慢性腎臟疾病有關(guān)[18]。在本研究中，我們?cè)噲D確定MAPKsp53caspase凋亡級(jí)聯(lián)在介導(dǎo)黑參和人參皂苷20（S）Rg3對(duì)腎細(xì)胞中氧化細(xì)胞毒性的保護(hù)作用中所扮演的成分。如圖2所示，順鉑治療24 h后，觀察磷酸化氨基末端激酶在用黑參及人參皂苷20（S）RG3處理后下降。然而，pERK和pP38沒有明顯的變化（數(shù)據(jù)未顯示）。

順鉑誘導(dǎo)的腎毒性依賴于DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。p53的蛋白水平在使用順鉑治療后顯著增加，而經(jīng)高濃度的黑參及人參皂苷20（S）RG3治療后大幅減少。類似地，用黑參和人參皂苷20（S）Rg3處理后，升高的切割的半胱天冬酶3水平也降低了。圖3顯示黑參提取物和人參皂苷20（S）Rg3對(duì)LLCPK1細(xì)胞凋亡的影響。如圖3A所示，使用順鉑治療后，被紅綠熒光染色的凋亡及死亡細(xì)胞的數(shù)量增加了，其數(shù)量在經(jīng)黑參尤其是與人參皂苷20（S）RG3聯(lián)合治療后降低。用黑參和人參皂苷20（S）Rg3進(jìn)行聯(lián)合治療后，順鉑治療誘導(dǎo)的凋亡LLCPK1細(xì)胞升高百分比明顯降低（圖3B）。

3討論

人參皂苷是三萜烷磺酸衍生的30碳糖苷，是人參的主要活性成分。人參皂苷抑制正常大鼠腎細(xì)胞中斑蝥素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。人參皂苷經(jīng)預(yù)處理降低了大鼠血清肌酐，尿蛋白，血尿素氮和組織學(xué)變化的增加[19]。這些結(jié)果可能反映了某些人參皂苷可改善藥物性腎毒性腎功能不全。

順鉑誘導(dǎo)的腎損傷與自由基和氧化應(yīng)激的形成有關(guān)，這種損傷可激活MAPKs[2022]。用抗氧化劑和胱天蛋白酶抑制劑治療可以緩解順鉑相關(guān)腎毒性的作用。有相當(dāng)多的證據(jù)表明該蛋白激酶、p53和半胱天冬酶途徑在凋亡途徑的調(diào)控以及炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明JNKp53caspase3信號(hào)級(jí)聯(lián)在介導(dǎo)黑參人參皂苷20（S）Rg3對(duì)培養(yǎng)的LLCPK1細(xì)胞中氧化細(xì)胞毒性的保護(hù)作用方面起關(guān)鍵作用。

人參通過減輕包括超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的抗氧化酶的活性以及谷胱甘肽的水平，顯示出對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎毒性的保護(hù)作用。這種效應(yīng)從而降低了氧化應(yīng)激、生化指標(biāo)的改變、組織學(xué)改變、基因組DNA損傷、以及表達(dá)TNFa、白細(xì)胞介素6、腫瘤抑制基因p53等指標(biāo)。人參皂苷F11經(jīng)預(yù)處理降低了順鉑誘導(dǎo)的血尿素氮和肌酐水平的升高，改善了組織病理學(xué)損傷。進(jìn)一步的研究表明，F(xiàn)11抑制p53的活化，反轉(zhuǎn)了B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白/B細(xì)胞淋巴瘤2的比例，順鉑誘導(dǎo)的抗氧化和自由基水平反過來抑制了腎小管細(xì)胞凋亡[2324]。然而，人參皂苷20（S）Rg3的效果和作用機(jī)制到目前為止尚未確定。

總之，我們的研究結(jié)果表明，人參皂苷20（s）Rg3可改善LLCPK1的細(xì)胞毒性，人參皂苷20（S）RG3可能是通過阻斷JNKP53caspase3信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來介導(dǎo)這種作用的重要組成部分。

參考文獻(xiàn)

[1]程慧，宋新波，張麗娟.人參皂苷Rg3與Rh2的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33（4）：307311.

[2]王修銀，成文利，饒子亮.十全大補(bǔ)湯對(duì)鏈脲佐菌素模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化的研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15（28）：12.

[3]安麗萍，王英平，劉曉梅，等.五味子油對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的影響[J].中草藥，2012，43（3）：552556.

[4]金勇，朱勇，吳南翔.實(shí)驗(yàn)性鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大、小鼠糖尿病動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（3）：8082.

[5]孫倩.人參皂苷Rb1對(duì)小鼠腸缺血再灌注致急性腎損傷保護(hù)作用中的分子機(jī)制研究[D].武漢：武漢大學(xué)，2014.

[6]吳勝斌，王應(yīng)燈.人參皂苷Rg_3對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2015，30（12）：14371442.

[7]曹霞，谷欣權(quán)，陳燕萍，等.人參皂苷Re對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎功能及ATP酶的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13（08）：10251027.

[8]石艷，王陸飛，羅萍，等.慶大霉素誘導(dǎo)急性腎損傷大鼠模型腎損傷分子1的表達(dá)[J].中國生物制品學(xué)雜志，2010，23（07）：700703.

[9]孫雪峰.Prohibitin的組蛋白乙?；揎椊閷?dǎo)慶大霉素誘導(dǎo)腎損傷的機(jī)制研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2014.

[10]向麗，林波，張祎，等.保腎顆粒對(duì)慶大霉素所致大鼠急性腎功能衰竭的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床，2014，30（04）：104108.

[11]Chiou YY，Lee YC，Chen MJ.Cyclosporinebased immunosuppressive therapy for patients with steroidresistant focal segmental glomerulosclerosis： a metaanalysis[J].Curr Med Res Opin，2017，33（8）：13891399.

[12]Curthoys NP，Gstraunthaler G.pHresponsive，gluconeogenic renal epithelial LLCPK1FBPase+cells： a versatile in vitro modelto study renal proximal tubule metabolism and function[J].Am J Physiol Renal Physiol，2014，307（1）：F1F11.

[13]Lee D，Choi YO，Kim KH，et al.Protective effect of αmangostin against iodixanolinduced apoptotic damage in LLCPK1 cells[J].Bioorg Med Chem Lett，2016，26（15）：38069.

[14]汪艷，肖媛，劉偉，等.流式細(xì)胞儀檢測(cè)高等植物細(xì)胞核DNA含量的方法[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，33（01）：126131.

[15]吳建勇，趙德璋.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的幾種方法的比較[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)；2010，35（09）：13861389.

[16]顏煊，李玉玲，趙日升，等.人參皂甙對(duì)急性腎衰大鼠的腎保護(hù)作用與外周腎小管上皮細(xì)胞氮能機(jī)制[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（04）：279282.

[17]焦今文，趙新衛(wèi)，鄧博雅，等.p38～（MAPK）對(duì)卵巢癌順鉑耐藥作用及機(jī)制的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2012，19（16）：12211226.

[18]孫家躍.順鉑腎毒性機(jī)制及防護(hù)方法的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2010，10（05）：478480.

[19]Stallone G，Di PS，Schena A，et al.Early withdrawal of cyclosporine A improves 1year kidney graft structure and function in sirolimustreated patients[J].Transplantation，2003，75（7）：9981003.

[20]焦今文，趙新衛(wèi)，鄧博雅，等.p38～（MAPK）對(duì)卵巢癌順鉑耐藥作用及機(jī)制的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2012，19（16）：12211226.

[21]查全斌，張華，唐金海，等.紫杉醇順鉑對(duì)HCC1937人乳腺癌細(xì)胞MAPK信號(hào)通路影響[J].中國腫瘤臨床，2012，39（19）：13971400.

[22]邢奮麗，唐輝，鄧毅，等.順鉑導(dǎo)致螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中pp38MAPK和pERK信號(hào)蛋白的作用[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2014，22（4）：399402.

[23]查全斌，張華，唐金海，等.紫杉醇順鉑對(duì)HCC1937人乳腺癌細(xì)胞MAPK信號(hào)通路影響[J].中國腫瘤臨床，2012，39（19）：13971400.

[24]羅景慧，楊迎暴，安田日出夫，等.N乙酰半胱氨酸影響p38有絲分裂原活化蛋白激酶對(duì)順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（2）：229233.

（2017-11-03收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）