辣蓼提取物對(duì)大鼠急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用研究

任守忠 蘇文琴 朱宏銳 王寧 牛海艷 趙雅媚 馬志健

中圖分類(lèi)號(hào) R285；R961 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）07-0955-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.22

摘 要 目的：研究辣蓼提取物對(duì)大鼠急性胃黏膜損傷（AGML）的保護(hù)作用。方法：將48只大鼠隨機(jī)分為正常組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性組（鹽酸雷尼替丁，0.05 g/kg）和辣蓼提取物低、中、高劑量組（以生藥量計(jì)分別為2.7、8.1、24.3 g/kg），連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。末次給藥1 h后，除正常組外，其余各組大鼠均灌胃無(wú)水乙醇復(fù)制AGML模型。造模1.5 h后，計(jì)算各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)，觀察大鼠胃組織病理學(xué)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠胃組織中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜損傷明顯，黏膜下層毛細(xì)血管破裂出血，胃黏膜損傷指數(shù)顯著升高（P<0.01）；胃組織中 Nrf2含量和SOD 活性顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠胃黏膜的損傷均不同程度減輕；陽(yáng)性組和辣蓼提取物中、高劑量組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)顯著降低（P<0.05），胃組織中Nrf2含量和SOD 活性顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：辣蓼提取物對(duì)無(wú)水乙醇致大鼠AGML具有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高胃黏膜組織中Nrf2含量和增強(qiáng)SOD 活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 辣蓼提取物；急性胃黏膜損傷；核因子E2相關(guān)因子2；超氧化物歧化酶；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of Polygonum hydropiper extract on acute gastric mucosal lesion （AGML） in rats. METHODS： 48 rats were randomly divided into normal group （normal saline）， model group （normal saline）， positive group （ranitidine hydrochloride， 0.05 g/kg）， P. hydropiper extract low-dose， medium-dose and high-dose groups （2.7， 8.1， 24.3 g/kg by crude drug）， i.g. for consecutive 7 d， once a day. Except for normal group， other groups were given absolute ethyl alcohol to induce AGMI model after 1 h of last administration. 1.5 h after modeling， gastric mucosal lesion index of rats was calculated； the pathological changes of gastric tissue in rats were observed； nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2） content and SOD activity in gastric tissue of rats were determined by ELISA. RESULTS： Compared with normal group， the gastric mucosa of model group was damaged obviously， there was blood capillary rupture in submucosa， gastric mucosal lesion index was increased significantly（P<0.01）； Nrf2 content and SOD activity were significantly decreased in gastric tissue of rats （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， gastric mucosal lesion of rats was relieved to different extent； in positive group， P. hydropiper extract medium-dose and high-dose groups， gastric mucosal lesion index was decreased significantly （P<0.05）， and Nrf2 content and SOD activity were increased significantly（P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： P. hydropiper extract has good protective effect on absolute ethyl alcohol-induce AGMI， the mechanism of which may be associated with raising Nrf2 content and enhancing SOD activity in gastric mucosal tissue.

KEYWORDS Polygonum hydropiper extract； Acute gastric mucosal lesion； Nuclear factor E2 related factor 2； SOD； Rats

辣蓼為蓼科（Polygonaceae）蓼屬植物辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）的干燥全草，也稱(chēng)水蓼、蓼芽菜、柳蓼，其味辛、酸，性溫，具有祛風(fēng)利濕、解毒消腫、散瘀止痛、殺蟲(chóng)止癢等功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、疥癬、胃腸炎、功能性子宮出血、痢疾、腹瀉、腳氣和跌打腫痛等[1]，其主要含黃酮和倍半萜和酚酸類(lèi)成分。藥理研究表明，辣蓼具有廣譜的抗菌以及抗炎、抗氧化、抗腹瀉等作用[2-3]，在臨床上用于治療急、慢性胃腸炎，具有良好療效。研究表明[4-5]，在急性胃黏膜損傷（AGML）的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中氧自由基參與并發(fā)揮了重要作用，過(guò)量自由基會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化及共價(jià)鍵結(jié)合，從而造成胃黏膜損傷。超氧化物歧化酶（SOD）能清除自由基，減輕過(guò)量自由基引起的損傷。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)鍵性因子，其通過(guò)激活機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，保護(hù)胃黏膜免受氧化應(yīng)激損害[6]。故本研究旨在觀察辣蓼提取物對(duì)大鼠AGML的改善作用，并通過(guò)考察胃組織中Nrf2含量和SOD活性對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為防治胃腸疾病中藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

TP-1200C電子天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DZF- 6020真空干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；T25電動(dòng)勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MK3酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）]；BH-2光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸雷尼替丁膠囊（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：LN140967，規(guī)格：0.15 g/粒）；SOD、Nrf2試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20160428、20160503）；甲醇（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20140919，分析純）；無(wú)水乙醇（西隴化工股份有限公司，批號(hào)：15070702，純度：99.5%）。

1.3 藥材

辣蓼于2016年5月采自海南省，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院曾念開(kāi)老師鑒定為蓼科蓼屬草本植物辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）的干燥全草。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠48只，清潔級(jí)， ♀♂各半，體質(zhì)量（180±20） g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011]。購(gòu)入后將大鼠飼養(yǎng)于室溫為25～27 ℃的動(dòng)物房中，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 辣蓼提取物的制備

取辣蓼藥材1 kg，粉碎成粗粉，加10倍量水浸泡2 h，然后加熱煮沸2 h，濾過(guò)，收集濾液；濾渣加8倍量水加熱煮沸1.5 h，濾過(guò)，收集濾液；濾渣繼續(xù)加6倍量水加熱煮沸1 h，濾過(guò)。合并3次濾液，濃縮，即為辣蓼水提液。取一定量辣蓼水提液上AB-8大孔吸附樹(shù)脂，先用蒸餾水洗脫，然后用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，即得。

2.2 分組與給藥

將48只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、陽(yáng)性組和辣蓼提取物低、中、高劑量組，每組8只。正常組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，陽(yáng)性組大鼠灌胃鹽酸雷尼替丁水溶液0.05 g/kg（根據(jù)成人臨床用量按照換算系數(shù)法換算而得），辣蓼提取物低、中、高劑量組大鼠分別灌胃辣蓼提取物（以生藥量計(jì)分別為2.7、8.1、24.3 g/kg，其中低劑量為成人臨床用量按照換算系數(shù)法換算而得，各組大鼠均每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.3 AGML模型的制備

末次給藥前，各組大鼠均禁食不禁水24 h。末次給藥后1 h，除正常組以外，其余各組大鼠均灌胃無(wú)水乙醇（1.5 mL/只）誘導(dǎo)AGML[7]。

2.4 胃黏膜膜損傷指數(shù)的測(cè)定

造模1.5 h后，脫頸處死大鼠，打開(kāi)腹腔，取出全胃，沿著胃大彎剪開(kāi)，用生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物，吸水紙吸干，將胃平鋪于試紙上，置于10倍放大鏡下肉眼觀察，用游標(biāo)卡尺測(cè)量胃黏膜損傷長(zhǎng)度和寬度，分級(jí)計(jì)分[8]：斑點(diǎn)糜爛≤1 mm，計(jì)1分；1 mm<損傷長(zhǎng)度≤2 mm，計(jì)2分；2 mm<損傷長(zhǎng)度≤3 mm，計(jì)3分；3 mm<損傷長(zhǎng)度≤4 mm，計(jì)4分；損傷長(zhǎng)度>4 mm，分段計(jì)分；寬度≥2 mm則計(jì)分加倍。累計(jì)得分即為胃黏膜損傷指數(shù)。

2.5 胃組織病理形態(tài)學(xué)的觀察

將胃組織置于4%中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.6 胃組織中Nrf2含量和SOD活性的測(cè)定

取胃組織用濾紙拭干，稱(chēng)質(zhì)量，剪碎，放入5 mL離心管中，取9倍量冰生理鹽水于離心管中，用組織勻漿機(jī)充分研磨制成10%組織勻漿，然后以5 000×g離心10 min，取上清，備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)胃組織中Nrf2含量和SOD活性，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜損傷嚴(yán)重，胃黏膜損傷指數(shù)明顯升高（P<0.01），提示AGML大鼠模型制備成功。與模型組比較，陽(yáng)性組和辣蓼提取物中、高劑量組大鼠胃黏膜損傷減輕，胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 胃組織病理學(xué)觀察結(jié)果

正常組大鼠胃黏膜層光滑完整、結(jié)構(gòu)層次清晰，黏膜下層及肌層完好。模型組大鼠黏膜破損、不完整，部分腺體被破壞；黏膜下層內(nèi)毛細(xì)血管破裂出血及滲出。辣蓼提取物低劑量組大鼠黏膜表層不完整，部分脫落。陽(yáng)性組和辣蓼提取物中、高劑量組大鼠黏膜層完整，腺體細(xì)胞排列比較整齊；黏膜下層及漿膜層基本完整，各組大鼠胃組織病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3 胃組織中Nrf2含量和SOD活性測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠胃組織中Nrf2含量和SOD 活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，辣蓼提取物中、高劑量組大鼠胃組織中Nrf2含量明顯升高（P<0.05或P<0.01），陽(yáng)性組和辣蓼提取物中、高劑量組大鼠胃組織中SOD活性均明顯升高（P<0.05或P<0.01），其中以辣蓼提取物高劑量組升高最為顯著，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

引起胃黏膜損傷的因素眾多，主要原因是由于胃黏膜防御因子和損傷因子的平衡消失[9-11]。乙醇是引發(fā)胃黏膜損傷的重要攻擊因子之一，進(jìn)入人體后的乙醇大約有20%以上的乙醇在胃部吸收，其能直接損傷胃黏膜和破壞胃黏膜屏障而導(dǎo)致胃黏膜損傷[12]。本研究采用無(wú)水乙醇誘導(dǎo)大鼠AGML，研究辣蓼提取物對(duì)AGML的防治作用。病理結(jié)果顯示，模型組大鼠黏膜損傷明顯，部分腺體被破壞；黏膜下層內(nèi)毛細(xì)血管破裂出血及滲出。辣蓼提取物中、高劑量組大鼠胃黏膜層基本完整，腺體細(xì)胞排列比較整齊，黏膜下層及漿膜層較完好，且胃黏膜損傷指數(shù)顯著降低，而辣蓼提取物低劑量組大鼠胃黏膜破壞仍明顯，部分黏膜腺脫落，這說(shuō)明中、高劑量辣蓼提取物能明顯減輕無(wú)水乙醇所致大鼠胃黏膜損傷。

SOD是機(jī)體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性氧自由基清除劑，能有效地清除氧自由基，抑制胃黏膜中的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并能穩(wěn)定細(xì)胞膜，起到保護(hù)胃黏膜的作用[13]，故機(jī)體內(nèi)環(huán)境中SOD活性的高低可間接性地反映機(jī)體清除自由基的能力。由表2結(jié)果可知，辣蓼提取物中、高劑量組大鼠胃組織中SOD活性較模型組明顯升高，這表明中、高劑量辣蓼提取物能增強(qiáng)胃黏膜損傷大鼠的抗氧化能力，進(jìn)而抑制胃黏膜損傷的發(fā)生和發(fā)展，這可能是其抗胃潰瘍的機(jī)制之一。Nrf2是氧化應(yīng)激中抗氧化基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，可促使Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keapl）解離和釋放[14]，然后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf蛋白形成異二聚體，后者再與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合后啟動(dòng)下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)，從而提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和解毒的能力[15]。本研究結(jié)果表明，辣蓼提取物中、高劑量組大鼠胃組織中Nrf2含量較模型組明顯升高，這提示中、高劑量辣蓼提取物可通過(guò)提高Nrf2水平，促進(jìn)下游抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)胃黏膜的抗氧化能力。

綜上所述，辣蓼提取物對(duì)無(wú)水乙醇誘導(dǎo)的大鼠AGML有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與升高胃組織中Nrf2含量和增強(qiáng)SOD活性，促進(jìn)活性氧的清除，增強(qiáng)胃黏膜的抗氧化能力相關(guān)，但其對(duì)抗氧化基因表達(dá)的影響以及相互關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2017-10-09 修回日期：2017-11-17）

（編輯：林 靜）