HPLC法同時測定桑白皮中6種活性成分的含量

陳志永 蒙麥俠 楊媛媛 杜霞 楊智峰 任慧

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0911-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.11

摘 要 目的：建立同時測定桑白皮中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素等6種活性成分含量的方法，為完善桑白皮的質(zhì)量控制標準提供參考。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent 5 TC-C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸（梯度洗脫），流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm。結(jié)果：新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.001 06～0.042 4、0.001 67～0.066 8、0.007 95～0.318、0.001 65～0.066 0、0.005 00～0.200和0.001 24～0.049 6 mg/mL（r均≥0.999 6），定量限分別為0.11、0.14、0.81、0.17、0.45和0.12 μg/mL，檢測限分別為0.04、0.05、0.41、0.07、0.18和0.04 μg/mL，精密度試驗的RSD分別為0.26%、0.31%、0.24%、0.27%、0.36%和0.44%（n=6），穩(wěn)定性試驗的RSD分別為0.68%、0.54%、0.62%、0.53%、0.41%和0.73%（n=6），平均方法回收率為99.1%、98.8%、98.8%、98.4%、98.5%和99.9%（RSD為0.5%～1.5%，n=9）。結(jié)論：該法簡便、準確，可用于桑白皮中6種活性成分的同時測定。

關(guān)鍵詞 桑白皮；高效液相色譜法；新綠原酸；桑皮苷A；綠原酸；紫云英苷；桑根酮C；桑辛素；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the simultaneous determination of content of 6 active components as neochlorogenic acid， mulberroside A， chlorogenic acid， astragalin， sanggenon C and morusin in Morus alba， and to provide reference for improving quality control standard of M. alba. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent 5 TC-C18 with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength of 280 nm. RESULTS： The mass concentration linear range of neochlorogenic acid， mulberroside A， chlorogenic acid， astragalin， sanggenon C and morusin were 0.001 06-0.042 4， 0.001 67-0.066 8， 0.007 95-0.318， 0.001 65-0.066 0， 0.005 00-0.200 and 0.001 24-0.049 6 mg/mL， respectively （all r≥0.999 6）； the limits of quantitation were 0.11， 0.14， 0.81， 0.17， 0.45 and 0.12 μg/mL， respectively； the limits of detection were 0.04， 0.05， 0.41， 0.07， 0.18 and 0.04 μg/mL， respectively； RSDs of precision test were 0.26%， 0.31%， 0.24%， 0.27%， 0.36% and 0.44% （n=6）， respectively； RSDs of stability test were 0.68%， 0.54%， 0.62%， 0.53%， 0.41% and 0.73%（n=6）， respectively； average method recovery rates were 99.1%， 98.8%， 98.8%， 98.4%， 98.5% and 99.9%（RSDs were 0.5%-1.5%， n=9）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， and can be used for simultaneous determination of 6 active components in M. alba.

KEYWORDS Morus alba； HPLC； Neochlorogenic acid； Mulberroside A； Chlorogenic acid； Astragalin； Sanggenon C； Morusin； Content determination

桑白皮是桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥根皮，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有瀉肺平喘、利水消腫之功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑白皮具有降血糖、降血壓、利尿等作用[2]。桑白皮中主要含有黃酮類、酚酸類、生物堿類等成分，其中異戊烯基黃酮類、黃酮醇類、酚酸類成分含量較高[2]。但2015年版《中國藥典》（一部）中未對桑白皮含量測定項進行規(guī)定。段志濤等[2]報道了桑白皮中桑根酮C、桑根酮D及1-脫氧野尻霉素含量的測定方法；閆輝等[3]建立了桑白皮中綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、白藜蘆醇和桑色素含量測定的方法。但上述方法存在質(zhì)控指標性成分較少，或無法兼顧桑白皮中不同極性活性成分等問題。鑒于此，本研究擬建立同時測定桑白皮中6種主要活性成分——新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素含量的方法，為桑白皮的質(zhì)量控制提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜（HPLC）儀，包含紫外檢測器（日本島津公司）；BS210S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司，d=0.1 mg）；KQ5200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 對照品與試劑

新綠原酸（批號：12113001）、桑皮苷A（批號：161112）、綠原酸（批號：151217）、紫云英苷（批號：140712）、桑根酮C（批號：16092105）、桑辛素（批號：161109）對照品（上海圻明生物有限公司，純度：均>98%）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

不同批次桑白皮藥材的采收地、采收時間和批號等信息詳見表1。所有樣品經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院陳志永博士鑒定均為真品，標本存放于陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min， 9%B； 5～13 min， 9%～13%B； 13～22 min，13%～22%B； 22～31 min， 22%～34%B； 31～44 min， 34%～48%B； 44～54 min， 48%～53%B； 54～59 min， 53%～65%B； 59～75 min， 65%B； 75～80 min， 65%～79%B）；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。取“2.2.1”項下混合對照品溶液、“2.2.2”項下供試品溶液適量，按此色譜條件進樣測定。結(jié)果表明，理論板數(shù)按新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素峰計均>4 000，相鄰峰間分離度均>1.5，各成分基線分離良好，色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取一定量的新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素對照品，加入80%甲醇溶液制備成各成分質(zhì)量濃度分別為0.042 4、0.066 8、0.318、0.066 0、0.200、0.049 6 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取桑白皮樣品粉末（過50目篩）0.5 g，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇溶液25 mL，稱質(zhì)量。加熱回流提取1 h，放冷，再稱質(zhì)量，用80%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，再用80%甲醇溶液分別稀釋0、2、4、20、40倍，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，以混合對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，結(jié)果各成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好（r均≥ 0.999 6），各成分的回歸方程和線性范圍詳見表2。

2.4 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10 ∶ 1時得定量限（LOQ），當信噪比為 3 ∶ 1時得檢測限（LOD）。結(jié)果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素的LOQ分別為0.11、0.14、0.81、0.17、0.45和0.12 μg/mL，LOD分別為0.04、0.05、0.41、0.07、0.18和0.04 μg/mL。

2.5 精密度試驗

取制備好的分別含新綠原酸0.007 07 mg/mL、桑皮苷A 0.011 1 mg/mL、綠原酸0.053 0 mg/mL、紫云英苷0.011 0 mg/mL、桑根酮C 0.033 3 mg/mL和桑辛素 0.008 27 mg/mL的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素峰面積的RSD分別為0.26%、0.31%、0.24%、0.27%、0.36%和0.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一桑白皮供試品（編號1）溶液，室溫下分別放置0、4、8、12、24、48 h后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素峰面積的RSD分別為0.68%、0.54%、0.62%、0.53%、0.41%和0.73%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一桑白皮樣品（編號1），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素峰面積的RSD分別為1.52%、1.63%、1.14%、1.27%、0.74%和2.15%（n=6），表明所建立含量測定方法重復(fù)性良好。

2.8 準確度試驗

精密稱取已知新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素含量的桑白皮樣品（編號1）0.25 g，分別精密加入已知桑白皮中6個化合物含量80%、100%、120%的對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每一質(zhì)量濃度制備3份樣品，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，6種成分的平均加樣回收率在98.4%～99.9%之間，RSD均<1.5%（n=9），表明該方法準確度較好，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

精密稱取不同批次桑白皮藥材樣品0.5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每批樣品同時制備3份。按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。采用外標法計算樣品中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素的含量。結(jié)果，不同批次桑白皮藥材中桑根酮C含量較高，新綠原酸含量較低，部分藥材中未檢測到新綠原酸，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 桑白皮的應(yīng)用前景

桑白皮在我國具有悠久的藥用歷史，常用于治療肺熱喘咳、水腫脹滿尿少和面目肌膚浮腫等[4-7]。有學(xué)者對266種生藥提取物進行了葡萄糖苷酶Ⅱ抑制活性測試，發(fā)現(xiàn)桑白皮提取物具有顯著的葡萄糖苷酶Ⅱ抑制活性[5]。近年來的研究證實，桑白皮中多種成分具有顯著的降血糖作用[8]。相比同樣來自桑樹的中藥桑葉，桑白皮富含大量具有顯著降糖作用的異戊烯基黃酮類成分，這使得桑白皮在降血糖方面具有更加廣泛的應(yīng)用前景[9]。

3.2 測定指標的選擇

本研究結(jié)合桑白皮的臨床藥效，最終確定對桑白皮中的新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素進行含量測定。其中，綠原酸、新綠原酸具有抗氧化、保肝等活性[10-12]；桑皮苷A在大鼠體內(nèi)約有50%轉(zhuǎn)化為氧化白藜蘆醇后被吸收進入血液循環(huán)，而氧化白藜蘆醇可通過提高β細胞分泌能力和抑制β細胞凋亡發(fā)揮其降糖作用[5，13]；紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗過敏和抗肝毒等作用[14-15]；桑根酮C和桑辛素在筆者前期篩選研究中表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

3.3 檢測波長的選擇

綜合各化合物紫外吸收特征和相關(guān)文獻報道，在前期研究中筆者重點考察了桑白皮提取物在紫外254、280、350、360 nm波長下的樣品信息采集情況。結(jié)果，在紫外280 nm波長下檢測可獲得較高的檢測靈敏度和較少的干擾，故最終以此為檢測波長。

3.4 提取方法的選擇

在前期研究中，筆者比較了60%甲醇、80%甲醇、無水甲醇、無水乙醇和乙酸乙酯5種溶劑對6種成分提取效率的影響。結(jié)果顯示，80%甲醇能兼顧不同極性化合物提取效率，提取效果最佳。同時，筆者還考察了超聲提取法和熱回流提取法兩種方法對桑白皮樣品提取的影響。結(jié)果顯示，熱回流提取法效率較高，并以提取1 h效果最佳。不同批次桑白皮藥材的含量測定結(jié)果表明，桑白皮中含有大量的桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素，而新綠原酸含量較低。經(jīng)方法學(xué)考察，本研究建立的聯(lián)合含量測定方法簡單可行、重現(xiàn)性好，可為桑白皮藥材的質(zhì)量控制，尤其是含有桑白皮或其活性組分降糖藥物的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2017-10-23 修回日期：2017-12-15）

（編輯：林 靜）