四味降酶片的質(zhì)量標準研究

張世曉 張星星 王香粉 李恒

中圖分類號 R917；R927 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）08-1040-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.07

摘 要 目的：建立四味降酶片的質(zhì)量標準。方法：采用薄層色譜法（TLC）對制劑中丹參、茵陳和蒲公英進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中綠原酸的含量，色譜柱為Agilent 5 TC-C18，流動相為乙腈-3%乙酸溶液（10 ∶ 90，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為327 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為20 ?L。結(jié)果：丹參、茵陳和蒲公英的TLC圖斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。綠原酸檢測進樣量線性范圍為0.26～0.79 ?g（r=0.999 9）；定量限、檢測限分別為0.26、0.12 ?g；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于1.0%；加樣回收率為96.11%～101.96%（RSD=1.98%，n=9）。結(jié)論：所建標準可用于四味降酶片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 四味降酶片； 薄層色譜法； 高效液相色譜法；綠原酸；質(zhì)量標準

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard for Siwei jiangmei tablets. METHODS： TLC method was used for the qualitative identification of Salvia miltiorrhiza， Artemisiae Scopariae Herba and Taraxaci Herba. HPLC method was adopted for the content determination of chlorogenic acid. The determination was performed on Agilents TC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-3% acetic acid （10 ∶ 90，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 327 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 10 ?L. RESULTS： TLC spots of S. miltiorrhiza， Artemisiae Scopariae Herba and Taraxaci Herba were clear and well-separated without interference from negative control. The linear range of chlorogenic acid was 0.26-0.79 ?g for （r=0.999 9）. The limits of quantitation and detection were 0.26，0.12 ?g，respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were lower than 1.0%. The recoveries were 96.11%-101.96% （RSD=1.98%，n=9）. CONCLUSIONS： Established standard can be used for quality control of Siwei jiangmei tablets.

KEYWORDS Siwei jiangmei tablets； TLC； HPLC； Chlorogenic acid； Quality standard

四味降酶片是我院制劑室根據(jù)中醫(yī)中藥理論自行研制且臨床應(yīng)用功效顯著的中藥制劑。該處方由蒲公英、車前草、丹參、茵陳等4味中藥材組合而成。方中蒲公英苦、甘，寒，歸肝、胃經(jīng)，有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之功效[1]，有研究發(fā)現(xiàn)其具有廣譜抑菌活性，并且可增強機體免疫[2-3]；車前草具有清熱利尿通淋、祛痰、涼血、解毒、抗炎和保肝作用[1，4]；丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效，對受損肝細胞也有一定的保護作用[1，5]；茵陳具有清利濕熱、利膽保肝的作用[1，6]。我院多年臨床經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，上述4味藥材合用具有清熱解毒、利濕去黃、利膽保肝、活血化瘀之功效，可用于慢性乙型肝炎、急性黃疸性肝炎的快速退黃，但目前尚缺乏該制劑的質(zhì)量標準。本研究采用薄層色譜法（TLC）對制劑中茵陳、蒲公英和丹參進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對制劑中茵陳和蒲公英的主要成分綠原酸[7]進行含量測定，以為其質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200 LC型HPLC儀，包括TU-1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S型電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

四味降酶片（解放軍第159醫(yī)院制劑室自制，批號：161203、161205、161208，規(guī)格：0.25 g/片）； 丹參對照藥材（批號：120923-201615）、茵陳對照藥材（批號：120950-201007）、蒲公英對照藥材（批號：121195- 201503）、綠原酸對照品（批號：110753-201415，純度：96.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 丹參 取樣品適量，除去包衣，研細，精密稱取粉末2 g，加水15 mL、鹽酸1 mL，超聲（功率：80 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取丹參對照藥材細粉（過2號篩）1 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按四味降酶片處方和工藝制備缺丹參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[1]試驗，吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各3 μL，對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-甲酸乙酯-甲醇-甲酸（2 ∶ 3 ∶ 4 ∶ 0.5 ∶ 2，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1。

2.1.2 茵陳和蒲公英 取樣品適量，除去包衣，研細，精密稱取粉末1.5 g，加50%甲醇溶液20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取茵陳對照藥材和蒲公英對照藥材各0.5 g，分別加50%甲醇溶液20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加50%甲醇溶液1 mL使溶解，制成單一對照藥材溶液。取綠原酸對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的對照品溶液。按四味降酶片處方和工藝制備缺茵陳和蒲公英的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[1]試驗，吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各4 μL，單一對照藥材溶液3 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7 ∶ 4 ∶ 2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈-3%乙酸溶液（10 ∶ 90，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 ?L[8-10]。

2.2.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液溶解制成綠原酸質(zhì)量濃度為260 ?g/mL的對照品貯備液。取上述對照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，即得綠原酸質(zhì)量濃度為26 ?g/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品適量，除去包衣，研細，稱取1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按四味降酶片處方和工藝制備缺茵陳和蒲公英的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，理論板數(shù)以綠原酸峰計大于5 000；各成分基線分離良好，分離度>1.5，詳見圖3。

2.2.6 專屬性試驗 取上述對照品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，待測成分出峰時間穩(wěn)定、峰形良好，陰性對照無干擾，詳見圖3。

2.2.7 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項下對照品溶液0.50、0.75、1.00、1.25、1.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以綠原酸進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得綠原酸回歸方程y=31 202x+96.57（r=0.999 9）。結(jié)果表明，綠原酸檢測進樣量線性范圍為0.26～0.79 ?g。

2.2.8 定量限與檢測限考察 分別精密量取“2.2.2”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。結(jié)果顯示，綠原酸的定量限與檢測限分別為0.26、0.12 μg。

2.2.9 中間精密度試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：161203）適量，在不同時間、不同人員、不同儀器設(shè)備情況下，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，綠原酸平均含量的RSD為0.03%，表明中間精密度良好。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：161203）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸峰面積的RSD為0.70%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.11 重復性試驗 精密稱取樣品（批號：161203）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，綠原酸含量平均值為1.502 mg/g，RSD為0.26%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.12 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：161203）適量，每份0.8 g，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的綠原酸對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.13 耐用性試驗 （1）色譜柱考察。取樣品（批號：161203）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件[色譜柱分別為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，詳見表2。結(jié)果表明，本色譜條件在一定色譜柱變動情況下耐用。（2）流動相考察。取樣品（批號：161203）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件[流動相乙腈-3%乙酸溶液比例（V/V）分別為8 ∶ 92、10 ∶ 90、12 ∶ 88]進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，詳見表2。結(jié)果表明，本色譜條件在一定流動相變動情況下耐用。（3）流速考察。取樣品（批號：161203）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件（流速分別為0.9、1.0、1.1 mL/min）進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，詳見表2。結(jié)果表明，本色譜條件在一定流速變動情況下耐用。（4）檢測波長考察。取樣品（批號：161203）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件（檢測波長分別為322、327、330 nm）進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，詳見表2。結(jié)果表明，本色譜條件在一定檢測波長變動情況下耐用。（5）柱溫考察。取樣品（批號：161203）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件（柱溫分別為20、25、30 ℃）進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，詳見表2。結(jié)果表明，本色譜條件在一定柱溫變動情況下耐用。

2.2.14 樣品含量測定 取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

根據(jù)綠原酸活性成分的極性，在預試驗中筆者分別以水和不同體積分數(shù)（10%、20%、30%、40%、50%、60%）的甲醇溶液作為提取溶劑[11]。結(jié)果顯示，50%甲醇溶液對綠原酸的提取率相對高于其他體積分數(shù)的甲醇溶液和水作為提取溶劑時的提取率。

四味降酶片在制備過程中采用的是傳統(tǒng)水提法，綠原酸成分的極性較大，筆者參考相關(guān)文獻[8-11]，考察了甲醇-0.5%乙酸溶液（20 ∶ 80，V/V）、乙腈-0.3%乙酸溶液（15 ∶ 85，V/V）、乙腈-0.1%甲酸溶液（15 ∶ 85，V/V）、乙腈-0.3%冰醋酸溶液（10 ∶ 90，V/V）為流動相時綠原酸的保留時間和分離度。結(jié)果顯示，流動相為乙腈-0.3%乙酸溶液（10 ∶ 90，V/V）時綠原酸的保留時間適宜且分離度較好。

筆者在選擇檢測波長時，對對照品溶液進行全波長掃描，結(jié)果綠原酸最大吸收波長為327 nm，因此本試驗設(shè)定波長為327 nm，既滿足了含量測定要求，又保證了結(jié)果的準確性。

綜上所述，本研究所建標準可用于四味降酶片的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-06-01 修回日期：2017-08-13）

（編輯：張 靜）