摻鍶對磷酸鍶鈣骨支架體外細(xì)胞毒性的影響研究*

鄺冠明李曉吳雋黃德民,呂維加

（1.深圳市創(chuàng)傷骨科新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，香港大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳 518053；2.香港大學(xué)矯形及創(chuàng)傷外科學(xué)系，香港 999077）

以磷酸鈣鹽（羥基磷灰石）為主要成分的骨水泥或骨支架材料，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，在骨科和牙科作為骨替代物，獲得了認(rèn)可[1-3]。但是，這類材料缺乏骨誘導(dǎo)性，不能誘導(dǎo)周圍組織成骨。因此，近年來研究者通過多種方法改良，使其獲得骨誘導(dǎo)性。其中一種策略就是在材料中整合具有一定成骨能力的有機(jī)或無機(jī)因子。

通過化學(xué)或物理的方法，將具有一定成骨活性的金屬離子，部分置換磷酸鈣鹽里的鈣離子，以改善這類骨支架材料的成骨誘導(dǎo)活性。由于鍶離子和鈣離子處于元素周期表的同一族，因此，兩種離子互相置換在化學(xué)上是可行的。另外，鍶離子是人體的微量元素，具有獨(dú)一無二的雙重作用，不僅能增加成骨細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)以及堿性磷酸酶活性，同時也能抑制破骨細(xì)胞的分化[4-6]。

目前，在磷酸鈣材料中摻鍶的方法主要有兩大類：一種是通過高溫結(jié)晶的方法，將鍶離子摻入磷酸鈣反應(yīng)體系，生成摻鍶的羥基磷灰石。這類方法制作出來的材料結(jié)晶度高，溶解度低，幾乎不降解，鍶離子釋放有限[7]；另外，這類摻鍶材料常以塊狀，顆粒狀成型。如果需要加工成可塑形的骨水泥材料，則要將其研磨成粉狀，然后通過聚合反應(yīng)來達(dá)到固化塑形的目的；但聚合反應(yīng)有發(fā)熱、釋放有毒單體等不良反應(yīng)[8]。另一種是通過類似傳統(tǒng)磷酸鈣骨水泥的水化/沉淀法，將有一定溶解度的鍶鹽（如氯化鍶、碳酸氫鍶、硫酸氫鍶等）與磷酸鹽混合，形成粉體相，然后再與液體相（水或者磷酸鹽溶液等）混合，形成超飽和溶液，最終沉淀生成熱力學(xué)最穩(wěn)定狀態(tài)的羥基磷灰石。由于鍶離子和鈣離子處于元素周期表的同一族，有相似的化學(xué)特性，在離子沉淀過程中，鍶離子與鈣離子會競爭位點(diǎn)，形成摻鍶的羥基磷灰石該方法在常溫下進(jìn)行，但沉淀速度慢，固化時間長不能完全滿足臨床要求[9]。

既往研究[10]提示，在磷酸鈣骨水泥體系中添加檸檬酸能加快骨水泥的固化反應(yīng)，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中，檸檬酸的羧基能與鈣離子或化學(xué)性質(zhì)類似的二價金屬離子螯合，形成螯合產(chǎn)物。因此，本研究將嘗試在液體相中添加檸檬酸，在粉體相中添加鍶鹽通過離子螯合的方法，制備出不同鍶/鈣比例的磷酸鍶鈣骨支架。考慮到這種方法制備出來的骨支架的細(xì)胞毒性尚未明確，因此本研究將檢測摻鍶對磷酸鍶鈣骨支架體外細(xì)胞毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

骨支架原始反應(yīng)物分為粉體相和液體相。其中液體相為20wt%的檸檬酸和12wt%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP K-30）的混合液，溶液pH調(diào)整為4。粉體相有3種成分：磷酸四鈣（tetracalcium phosphate,TTCP,Wako），無水磷酸二鈣（dicalcium phosphate anhy?drous,DCPA,Alfa Aesar）和磷酸氫鍶（strontium hydro?gen phosphate,DSPA,Sigma）。本研究按鍶/(鍶+鈣)[Sr/(Sr+Ca)]離子摩爾百分比0、5%、10%和20%，分為4組：Sr-0組、Sr-5組、Sr-10組和Sr-20組。Sr-0組不含鍶離子，粉體相僅包含磷酸四鈣和無水磷酸二鈣。在Sr-5組、Sr-10組和Sr-20組的粉體相中，用磷酸氫鍶置換部分的無水磷酸二鈣，使粉體相最終的鍶/(鍶+鈣)離子摩爾百分比分別為5%、10%和20%。以2 g/ml的比例將粉體相和液體混合，粉體相的磷酸鈣鹽和磷酸鍶鹽溶解，釋放出鍶、鈣離子和磷酸根離子，形成超飽和溶液，其中的鍶、鈣離子與檸檬酸根的羥基螯合。鍶和鈣離子處于元素周期表的同一族，可以競爭螯合位點(diǎn)，生成摻鍶的螯合產(chǎn)物[10]。

1.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO10993-12標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)液的成分主要是在DMEM培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加10%的胎牛血清、100 U/L的青霉素和100 mg/ml的鏈霉素。首先制作浸提液。將標(biāo)本按照0.1 g/ml的重量/體積百分比浸入細(xì)胞培養(yǎng)液里，然后在37℃，100%濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱里孵育24 h。陽性對照為0.02%的苯酚磷酸鹽緩沖溶液。陰性對照是純鈦合金的浸提液。細(xì)胞的成分為L929成纖維細(xì)胞。將1×104個L929細(xì)胞混懸在100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后置入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)24 h后，棄上清，加入浸提液，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用WST-1試劑盒計(jì)算細(xì)胞的相對生長率。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)使用類成骨細(xì)胞MG-63（ATCC）來進(jìn)行。首先制作直徑6 mm、厚度2 mm的骨支架標(biāo)本，然后應(yīng)用劑量25 kGy的銫-137對標(biāo)本進(jìn)行消毒（MDS Nordion Gammacell 3000 ElanⅡ）。將消毒后的標(biāo)本放置于96孔板。將100 μl培養(yǎng)液的懸浮MG-63細(xì)胞（1×103）接種在96孔板上，然后在37℃和100%相對濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液每天更換，培養(yǎng)1、3、7、14 d后，應(yīng)用WST-1試劑盒來測定細(xì)胞的增殖率。

1.4 堿性磷酸酶活力

將直徑12 mm、厚度2 mm的骨支架標(biāo)本放置于24孔板內(nèi)，將2×104個MG-63細(xì)胞稀釋到1 ml的培養(yǎng)液中，然后種植在培養(yǎng)孔。培養(yǎng)1、3、7和14 d后，仔細(xì)移除培養(yǎng)液，用PBS沖洗標(biāo)本，然后用200 μl的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。對細(xì)胞施加2個循環(huán)的凍結(jié)與解凍過程，充分裂解細(xì)胞。然后收集細(xì)胞裂解液，離心，取50 μl細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到96孔板，與200 μl含對硝基苯磷酸鹽（pNPP,Sigma）的反應(yīng)液混合。待充分反應(yīng)后，應(yīng)用50 μl 3 N NaOH溶液終止反應(yīng)。然后，使用分光光度儀（SpectraMax 340,Molecular Devices）在波長405區(qū)間測定堿性磷酸酶的活性。所測得的吸收值將和標(biāo)準(zhǔn)的吸收曲線相比較，并用總蛋白的量來標(biāo)準(zhǔn)化堿性磷酸酶的活性數(shù)。每組樣本5個。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

含2×104個MG-63細(xì)胞的培養(yǎng)液1 ml滴加在直徑12 mm、厚度2 mm的骨支架標(biāo)本上，分別培養(yǎng)1 d和14 d后，去除上清，用PBS仔細(xì)清洗標(biāo)本的表面，然后依次用50%、60%、70%、80%、90%及100%的梯度酒精脫水。脫水充分后在標(biāo)本表面鍍上20 nm厚的金，使用掃描電子顯微鏡（LEO 1530 FESEM,Oxford,UK）觀察細(xì)胞在骨支架表面的形態(tài)及貼附情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所獲數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表述。應(yīng)用one-way ANOVA對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，如果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步應(yīng)用Tukey's multiple comparison tests進(jìn)行post hoc分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性測試

所有組別100%細(xì)胞浸提液的相對細(xì)胞活力均超過陰性對照組的70%，提示所有浸提液均沒有細(xì)胞毒性（圖1）。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)1 d，細(xì)胞增殖的組間比較無顯著性差異。培養(yǎng)3 d，Sr-10組和Sr-20組的細(xì)胞增殖率較Sr-0組高。培養(yǎng)7 d和14 d，細(xì)胞增殖率與培養(yǎng)3 d的結(jié)果相似。培養(yǎng)7 d，所有摻鍶組OD值均比非摻鍶組高，提示摻鍶對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。但是，所有摻鍶組的組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)14 d，Sr-10組和Sr-20組的細(xì)胞增殖率最高，而Sr-0組最低（圖2）。

2.3 堿性磷酸酶活性

培養(yǎng)1 d，所有組的堿性磷酸酶活性水平相對較低。培養(yǎng)3 d，堿性磷酸酶活性均有明顯提高。與Sr-0組比較，Sr-10組和Sr-20組堿性磷酸酶活性較高。培養(yǎng)7 d，堿性磷酸酶活性進(jìn)一步增高，培養(yǎng)14 d，堿性磷酸酶活性水平較為平穩(wěn)，甚至有輕微下降，與Sr-0組比較，Sr-10組和Sr-20組堿性磷酸酶活性較高（圖3）。

圖1 細(xì)胞毒性測試的結(jié)果

圖2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

培養(yǎng)1 d，MG-63細(xì)胞在骨支架表面呈扁平狀，通過較長的突觸與骨支架表面連接（圖4A,C,E,G）。培養(yǎng)14 d，所有標(biāo)本的表面均被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞間緊密接觸（圖4B,D,F,H）。培養(yǎng)1 d，細(xì)胞表面無明顯的沉淀物，而培養(yǎng)14 d，細(xì)胞表面可見顆粒狀的沉淀物。

3 討論

臨床上修復(fù)形狀不規(guī)則的骨缺損，常需要一種可塑形的骨支架材料，以達(dá)到充分填充和全面修復(fù)的目的。以磷酸鈣鹽為主要成分的骨支架材料，可以利用其類似傳統(tǒng)骨水泥固化反應(yīng)過程中的可塑形期來達(dá)到充分填充的目的。通過將液體和粉體按一定比例混合，數(shù)分鐘內(nèi)反應(yīng)物即可形成可塑形的糊狀物，然后填充在缺損部位，最后固化成型，形成支架材料。磷酸鈣鹽支架材料因其成分與骨的無機(jī)成分類似，因此具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性以及生物安全性。但是，該類材料不具有骨誘導(dǎo)能力，無法促進(jìn)骨缺損在合理的時間愈合，延緩了患者的康復(fù)。

圖3 堿性磷酸酶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 細(xì)胞貼附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了提高骨支架材料的骨誘導(dǎo)能力，目前主要有兩大研究策略：一是通過優(yōu)化支架材料的表面特性和內(nèi)部空間孔隙結(jié)構(gòu)，以此改善支架材料的骨傳導(dǎo)性，利于骨組織在支架材料的表面貼附和內(nèi)部長入；另一策略就是在材料內(nèi)部整合具有一定生物活性的因子，通過活性因子的局部釋放，誘導(dǎo)材料周圍骨組織生長，從而使支架材料獲得一定的骨誘導(dǎo)性。目前已經(jīng)報(bào)道的成骨活性因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2），血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等[11-13]。但是這些生長因子主要成分是蛋白質(zhì)，在材料反應(yīng)的過程中有可能被局部的化學(xué)環(huán)境滅活。另外，這些蛋白質(zhì)在體內(nèi)有一定的半衰期，降解后將無法持續(xù)發(fā)揮作用。近年來，具有生物活性的金屬離子受到越來越多的關(guān)注。既往研究指出，鍶離子對骨骼系統(tǒng)有雙效的作用：促進(jìn)成骨和抑制破骨作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[14-16]證明，鍶離子能增加成骨細(xì)胞標(biāo)志物，如堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨鈣蛋白等的分泌，提示了鍶離子對骨代謝的正性作用。另外，鍶離子可以抑制碳酸酐酶Ⅱ玻璃粘連蛋白受體的分泌，抑制破骨細(xì)胞的分化，降低破骨細(xì)胞的骨吸收活性[4,5,14]。動物實(shí)驗(yàn)[17-19]結(jié)果顯示，鍶離子能刺激正常大鼠、骨質(zhì)疏松大鼠模型和骨質(zhì)疏松山羊模型的骨小梁和新骨生成，以及通過抑制骨吸收的機(jī)制來防止大鼠骨丟失，且不影響大鼠骨的生成。由于磷酸鈣鹽本身與骨的無機(jī)成分接近，可參與骨組織的鈣磷代謝，且磷酸鈣鹽可與鍶離子構(gòu)建金屬離子的螯合體系[20]，實(shí)現(xiàn)鍶離子的局部釋放，從而誘導(dǎo)支架材料周圍的新骨生成，促進(jìn)缺損部位的骨修復(fù)。因此，本研究以磷酸鈣鹽為基礎(chǔ)，用鍶離子置換部分鈣離子，制備摻鍶的骨支架材料。

本研究在液體相添加了具有羧基的檸檬酸，通過檸檬酸的羧基與鈣鍶離子進(jìn)行螯合反應(yīng)。由于鍶離子和鈣離子位于元素周期表的同一族，化學(xué)特性類似，因此在螯合過程中鍶和鈣能競爭螯合位點(diǎn)，生成摻鍶的螯合產(chǎn)物。另外，本研究也在摻鍶的反應(yīng)體系中使用PVP K-30，這是一種具有良好生物相容性的生物膠體，用于改善反應(yīng)體系的黏稠度[21,22]。因此，本研究具有一定的創(chuàng)新和先進(jìn)性。

本研究證實(shí)了添加不同劑量的鍶離子后，所有標(biāo)本均沒有細(xì)胞毒性。在細(xì)胞貼附實(shí)驗(yàn)中，在電子顯微鏡上可觀察到細(xì)胞開始以較長的突觸貼附在支架材料表面。在細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到細(xì)胞在材料表面增殖，并分泌堿性磷酸酶。細(xì)胞增殖的數(shù)量也隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸增加。摻鍶組細(xì)胞增殖更好，這結(jié)果與其他研究[14,23]結(jié)果相似。培養(yǎng)14 d，細(xì)胞增殖達(dá)最高水平，但此時各組堿性磷酸酶水平較為平穩(wěn)，沒有進(jìn)一步增加，甚至個別組出現(xiàn)較上個時間點(diǎn)降低的現(xiàn)象。根據(jù)St-Pierre等[24]和Kim等[25]的研究結(jié)果，細(xì)胞的增殖伴隨堿性磷酸酶活性的降低，提示成骨細(xì)胞礦化過程的開始。這一點(diǎn)在本研究細(xì)胞表面貼附的形貌學(xué)觀察中得到了進(jìn)一步的支持。培養(yǎng)14 d，細(xì)胞表面有大量的顆粒結(jié)節(jié)狀沉淀物，提示細(xì)胞的早期礦化，與既往一個研究小組的觀點(diǎn)相呼應(yīng)[26]。他們認(rèn)為，評估生物材料的表面活性不能僅觀察材料表面是否有羥基磷灰石的生成，因?yàn)檫@僅是材料表面的鈣和磷離子過度飽而形成的沉淀，不能反映材料表面對細(xì)胞增殖或細(xì)胞成骨活性的生物學(xué)影響。而更值得觀察的是，成骨性細(xì)胞在材料表面的增殖活性及礦化能力。因此，評估材料表面的生物活性，不僅需要評估細(xì)胞在材料表面增殖，而且需要評估細(xì)胞能否在材料表面獲得礦化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，添加了鍶離子的骨支架材料沒有細(xì)胞毒性，而骨支架材料具有更好的表面活性，體現(xiàn)在摻鍶組有更好的細(xì)胞增殖活性，并且細(xì)胞表面可觀察到早期的礦化。