成年大鼠心房成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法的建立

任雨潔，佘 剛，侯夢(mèng)晨，鄧秀玲，趙麗梅

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理系，陜西西安 710061)

心房結(jié)構(gòu)重塑，尤其是心房纖維化，是房顫持續(xù)發(fā)生的重要因素。心房纖維化通過持續(xù)性阻斷心房肌纖維束而導(dǎo)致局部傳導(dǎo)紊亂，進(jìn)而引發(fā)房顫。因此，控制心房纖維化可用來預(yù)防房顫復(fù)發(fā)[1]。房顫發(fā)生機(jī)制的研究涉及到心房成纖維細(xì)胞(atrial fibroblasts, AFs)，因此體外培養(yǎng)的AFs是研究心房纖維化機(jī)制的關(guān)鍵。但在當(dāng)前細(xì)胞分離技術(shù)中，AFs原代培養(yǎng)尚無成熟有效的方法，目前的研究多采用新生乳鼠整個(gè)心臟分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，缺乏心房特異性，且無法真實(shí)的反映成年AFs的特性。本研究首次嘗試使用成年大鼠心房組織，用混合酶消化法分離培養(yǎng)原代AFs，探索可行的成年大鼠AFs的體外培養(yǎng)方法，以期為相關(guān)研究提供更加可靠的體外細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawely(SD)大鼠，6周齡(約200 g)，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究方案通過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的審查并獲得批準(zhǔn)。

1.2主要試劑及器材膠原酶(Ⅱ型，Gibco)、胰蛋白酶(Sigma)、DMEM(Gibco)、新生胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, Gibco)，兔抗波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體、兔抗膠原受體2蛋白(DDR2)多克隆抗體、兔抗vWF、兔抗α-SMA均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Cy3(3H-吲哚菁類染料)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(西安壯志生物科技有限公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)、醫(yī)用凈化工作臺(tái)(北京半導(dǎo)管儀器廠)、低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、倒置相差顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、全自動(dòng)倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3方法

1.3.1心房消化液的配制 取0.048 g胰蛋白酶和0.024 g膠原Ⅱ型酶溶于60 mL PBS溶液中，混勻，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃保存。心房消化液終質(zhì)量濃度為胰蛋白酶0.8 g/L和膠原酶Ⅱ 0.4 g/L。

1.3.2AFs的分離及培養(yǎng) 將成年SD大鼠用0.1 g/L水合氯醛(30 μL/kg)麻醉，0.3 g/L肝素腹腔注射(2 mL/kg)。麻醉后大鼠仰置于預(yù)先紫外線消毒的密閉工作臺(tái)上，固定動(dòng)物四肢，使用無菌器械快速取出心臟，放入4 ℃預(yù)冷PBS溶液中，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)。用眼科鑷夾取心尖部位，仔細(xì)沿冠狀竇和右冠狀動(dòng)脈溝剪下左右心房，再夾取上腔靜脈，用眼科剪小心依次剔剪左右心耳與心房肌，去除左右肺靜脈和主動(dòng)脈。將心房肌組織剪成數(shù)塊，用4 ℃無菌PBS沖洗表面血液。用眼科剪將心房肌剪成約1 mm3的小塊，4 ℃無菌PBS沖洗2～3次。棄去沖洗液，將心肌轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，加入預(yù)溫的混合酶消化液2 mL，于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)消化。首次消化約5 min，見消化液渾濁呈乳白色后棄去所得細(xì)胞懸液(含大量血細(xì)胞)，加入新的消化液2 mL繼續(xù)消化約5 min(視消化程度而定)。在消化開始和結(jié)束時(shí)用吸管輕輕吹打瓶中液體。吸取管中上層細(xì)胞懸液，移入盛有約3 mL DMEM培養(yǎng)液(含10 mL/L FBS)的離心管中，置于4 ℃冰箱待用。重復(fù)以上步驟共7～8次，消化至組織基本消失為止。取暫存于4 ℃冰箱的收集細(xì)胞懸液的離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL含20 mL/L FBS的DMEM重懸細(xì)胞，以3.0×104/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，50 mL/L CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)70 min，棄掉培養(yǎng)液，再加入含20 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)至次融合狀態(tài)后用0.25 g/L胰酶(含有0.02 g/mL EDTA)消化，1∶2傳代。采用2～3代AFs進(jìn)行鑒定。

1.4AFs形態(tài)觀察與鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察酶消化分離時(shí)、差速貼壁70 min后及細(xì)胞傳代前后的細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及生長(zhǎng)情況等。

1.4.2鑒定 取2～3代的AFs以1×105個(gè)/孔接種于24孔板中，放入37 ℃含50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色。一抗為兔抗Vimentin多克隆抗體(1∶300)、兔抗DDR-2多克隆抗體(1∶300)、兔抗vWF(1∶300)、兔抗α-SMA(1∶300)，以PBS作為陰性對(duì)照；二抗為Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶300)；DAPI(1∶100)進(jìn)行細(xì)胞核染色，900 mL/L甘油封片，熒光倒置顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1AFs生長(zhǎng)觀察剛消化分離下來的細(xì)胞呈亮球形，輪廓清晰，單個(gè)散在分布或聚集成細(xì)胞團(tuán)。差速貼壁70 min后即有大量細(xì)胞貼壁，其中部分已開始伸展，表現(xiàn)為輪廓漸模糊(圖1A)；1～2 d后大多數(shù)貼壁細(xì)胞已伸展成短梭形，并散在生長(zhǎng)(圖1B)；3～4 d細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形或多角形，胞核清晰，可見大量的分裂相細(xì)胞，除貼壁的細(xì)胞團(tuán)外，一般不形成集落(圖1C)；5～6 d可形成細(xì)胞單層，漩渦狀或縱橫狀排列，貼壁的細(xì)胞團(tuán)呈放射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞接近于次融合狀態(tài)下進(jìn)行傳代(圖1D)。傳代細(xì)胞貼壁及伸展速度更快，多數(shù)細(xì)胞在60 min即開始伸展。在約3.0×104/cm2的接種密度及10 mL/L FBS培養(yǎng)條件下，1～2 d即可基本長(zhǎng)成細(xì)胞單層(圖1E)。隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)開始變慢，并出現(xiàn)一些體積較大，扁平伸展的多突紡錘形細(xì)胞或星形細(xì)胞，逐漸失去梭形形態(tài)(圖1F)。

圖1原代及傳代培養(yǎng)的成年大鼠AFs形態(tài)

Fig.1 The morphology of primary andsubcultured atrial cardiac fibroblasts from adult rats (×200)

A：差速貼壁后70 min；B：差速貼壁后24 h；C：差速貼壁后72 h；D：原代培養(yǎng)6 d；E：首次傳代后48 h；F：第5次傳代后72 h。

2.2AFs純度的鑒定經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)，體外培養(yǎng)的3代成年大鼠AFs Vimentin和DDR2表達(dá)均為陽(yáng)性，而anti-vWF及anti-α-SMA染色呈陰性(圖2)，說明此方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞為AFs，其純度為98%以上。

3 討 論

目前，AFs的離體培養(yǎng)主要有兩種方法：酶消化法及組織塊貼壁培養(yǎng)法。組織塊貼壁培養(yǎng)法多用于人AFs的分離[2-3]，主要是因?yàn)槿诵姆拷M織取材不易，較為珍貴，且組織比較嬌嫩，不能承受酶液的消化。雖然也有研究者采用組織塊貼壁培養(yǎng)法來培養(yǎng)大鼠心室成纖維細(xì)胞，但存在組織需求量大、原代培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、易污染等弊處。相對(duì)心室組織，大鼠心房組織量小，所需動(dòng)物成本高，故不宜采用組織塊貼壁法。酶消化法的原理是利用消化酶將細(xì)胞周邊的細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等消化去除，使細(xì)胞分散，利于分離培養(yǎng)。消化組織細(xì)胞常用的胰蛋白酶主要是分解細(xì)胞間質(zhì)的蛋白質(zhì)，作用較強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞膜有較強(qiáng)的破壞力，分離細(xì)胞時(shí)容易造成細(xì)胞損傷。膠原酶相對(duì)作用緩和，可以消化細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維[4]。心臟組織中有大量的膠原蛋白，故消化心肌組織內(nèi)的細(xì)胞多采用胰蛋白酶和膠原酶的混合酶液。目前的酶消化法所取組織來源均為大鼠、犬等動(dòng)物心肌組織[6]。研究表明，不同種屬和不同發(fā)育階段的心臟成纖維細(xì)胞其表型不盡相同[7]，對(duì)刺激因素的感受性也就有所差異，因此，有必要針對(duì)不同種屬的研究對(duì)象選擇同一種屬的細(xì)胞模型，以盡可能地模擬體內(nèi)的情況。目前，大量體外疾病模型的建立采用成年大鼠，而對(duì)AFs的研究，由于受細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的限制，多數(shù)研究人員采用乳鼠全心臟進(jìn)行消化分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞[7-8]。新生乳鼠心臟體積過小，分離AFs可行性甚小，也未見相關(guān)報(bào)道,并且整顆乳鼠心臟分離提取出的成纖維細(xì)胞，絕大多數(shù)為心室成纖維細(xì)胞(CFs)，CFs多用于室性心律失常機(jī)制的研究[9]，而研究房顫發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)—AFs應(yīng)均為心房來源。房顫雖為最常見的心律失常之一，但在健康人群中的發(fā)生率并不高，主要見于器質(zhì)性心臟病患者，隨著年齡的增長(zhǎng)，房顫發(fā)生率逐漸增加，為年齡依賴性疾病[10-11]、非幼齡疾病，故采用乳鼠分離AFs并不合適[8,10]。

近幾年，雖有學(xué)者采用原代培養(yǎng)大鼠AFs[11-12]，但提取方法多樣，并無報(bào)道統(tǒng)一的具體實(shí)驗(yàn)方法。本文具體闡述AFs提取及純化步驟，旨在建立成熟穩(wěn)定的大鼠AFs分離方法，為后續(xù)模型大鼠AFs分離提供了技術(shù)基礎(chǔ)，以便于離體研究與在體研究統(tǒng)一。

心臟成纖維細(xì)胞是細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞，其中有橢圓形細(xì)胞核[13]。成纖維細(xì)胞內(nèi)含有便于鑒定的特異性蛋白質(zhì)，即中間絲內(nèi)的Vimentin及更加具有特異性的DDR2[14-15]，后者在心肌細(xì)胞或心臟內(nèi)皮細(xì)胞中不存在[16]。在出生后的健康心臟中，心臟間質(zhì)中成纖維細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，而在心臟纖維化相關(guān)疾病進(jìn)程中，α-SMA的表達(dá)被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞激活、分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志[14]，后者具有收縮能力、更強(qiáng)的遷移、膠原合成及分泌等細(xì)胞功能，可誘發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，在心肌纖維化及心肌重塑的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17-18]。本研究中，對(duì)培養(yǎng)的成年大鼠AFs 3代細(xì)胞鑒定為成纖維細(xì)胞，其純度達(dá)98%左右。已有研究證明，在普通DMEM/F12培養(yǎng)液中添加TGF-β1，成纖維細(xì)胞能夠更為穩(wěn)定地分化為肌成纖維細(xì)胞[19]，并且普通培養(yǎng)液培養(yǎng)的低密度成纖維細(xì)胞可以自主地轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其主要原因是在低密度條件下，細(xì)胞之間不能相互接觸，為成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中提供了更多的 TGF-β1受體[20]，為細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞創(chuàng)造了有利條件。本研究中觀察到，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)開始變得緩慢且出現(xiàn)扁平伸展的多突紡錘形細(xì)胞或星形細(xì)胞，分析原因可能為細(xì)胞多次傳代生長(zhǎng)過程中，細(xì)胞存活數(shù)量減少、低密度培養(yǎng)及多次的細(xì)胞分裂引起的表型變化，使細(xì)胞失去成纖維細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)等部分特性，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞[12]。因此，在此基礎(chǔ)上的研究不能反映在體AFs的真實(shí)狀態(tài)，故不建議采用4代之后的AFs進(jìn)行相關(guān)研究，且每次接種密度不宜過小，以3×104/cm2的密度較為合適。

圖2免疫熒光法鑒定AFs

Fig.2 Identification of AFs by immunofluorescence (×100)