低產(chǎn)乙醇酵母的篩選及其在桑椹酒中的應(yīng)用

李 希， 肖露露， 馬永昆，2， 吳 夢(mèng)， Tchabo William， Kwaw Emmanuel

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2.鎮(zhèn)江市果圣源食品科技有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

桑椹(FructusMori)為?？粕俣嗄晟颈局参锷涞墓麑?shí)。我國種桑養(yǎng)蠶有五千多年的歷史，是中華民族農(nóng)業(yè)文明中最重要且最具影響力的標(biāo)志之一。隨著我國養(yǎng)生健康戰(zhàn)略的實(shí)施及人們對(duì)桑椹營養(yǎng)功能價(jià)值認(rèn)識(shí)的加深，由幾千年來單一的“種桑養(yǎng)蠶”向“栽桑養(yǎng)生”轉(zhuǎn)變發(fā)展已成為必然趨勢(shì)。據(jù)《本草綱目》等醫(yī)學(xué)典籍記載，桑椹有“固氣益腎、烏發(fā)明目、安神、解酒毒”等功效[1]，已被我國衛(wèi)生部列入“既是食品又是藥品”的名單[2]。相關(guān)研究表明，桑椹含活性多糖、花青素等，具有清除自由基、增強(qiáng)免疫力等作用[3-4]。

隨著生活水平的提高，現(xiàn)代人們更加追求營養(yǎng)和健康養(yǎng)生，低醇酒和無醇酒很可能是將來的發(fā)展方向。GB/T 15037—2006《葡萄酒》中定義低醇葡萄酒的乙醇度為1%～7%(體積分?jǐn)?shù))，但沒有關(guān)于低醇果酒的具體標(biāo)準(zhǔn)。目前生產(chǎn)低醇果酒的方法主要分為生物法和物理脫醇法。商業(yè)化的的物理脫醇方法主要為反滲透法[5]和滲透蒸發(fā)法[6]，但是最終酒中營養(yǎng)物質(zhì)和香氣成分含量較少，且成本高[7]。用生物法包括限制發(fā)酵法、特殊酵母如非釀酒酵母[8-9]和基因工程菌株[10]等方法來控制乙醇的產(chǎn)生，成本低，更具競(jìng)爭(zhēng)力。

目前用于發(fā)酵果酒的酵母絕大部分是商用葡萄酒酵母，雖然活性高、發(fā)酵快，但不一定適合桑椹酒。本研究擬通過篩選低產(chǎn)乙醇酵母來制備低醇桑椹酒，在桑椹自然發(fā)酵液和菌種公司推薦的用于奶酪生產(chǎn)的復(fù)合菌種中進(jìn)行分離純化，結(jié)合18S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建以鑒定菌株，并發(fā)酵桑椹汁釀造低醇桑椹酒，分析其花青素、多酚、黃酮等活性成分、香氣成分，結(jié)合感官評(píng)價(jià)篩選出更加適合發(fā)酵低醇桑椹酒的酵母，旨在為生產(chǎn)低醇果酒提供優(yōu)良酵母。

1 材料與方法

1.1 材料

桑椹品種為鎮(zhèn)椹1號(hào)，采自位于鎮(zhèn)江江心洲的鎮(zhèn)江桑樹圃。培養(yǎng)基為孟加拉紅(虎紅)培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)，購自杭州微生物試劑有限公司。釀酒活性干酵母，購自安琪酵母股份有限公司，編號(hào)為AQ1。

1.2 菌株的篩選及鑒定

1.2.1 菌株的篩選 用無菌鏟將桑椹果實(shí)搗碎后放入裝有滅菌YPD培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，于28 ℃發(fā)酵1周，在含有氯霉素的孟加拉紅培養(yǎng)基平板上稀釋涂布，倒置后于28 ℃培養(yǎng) 2 d。挑取具有酵母菌菌落形態(tài)特征的單個(gè)菌落，在YPD瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離純化直至鏡檢為純種并編號(hào)，然后劃線在YPD試管斜面上，于4 ℃冰箱保存，每3個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。實(shí)驗(yàn)室保存的用于奶酪發(fā)酵的復(fù)合菌種，其分離方法同上，并編號(hào)。

將菌株接到裝有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中，于 28 ℃ 培養(yǎng)，觀察并記錄菌株的產(chǎn)氣情況。將具有產(chǎn)氣現(xiàn)象的菌株接到桑椹汁(總糖含量為140 g/L，加入濃度為120 mg/L 的偏重亞硫酸鉀)中，于25 ℃發(fā)酵1周，離心后測(cè)定乙醇度(體積分?jǐn)?shù)，下同)并聞香。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株在YPD固體培養(yǎng)基上于 28 ℃ 培養(yǎng)，待長出明顯菌落后觀察其菌落特征，通過顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 采用凍融法提取DNA，以菌懸液為反應(yīng)底物擴(kuò)增18S rDNA進(jìn)行菌種鑒定，所用的正反引物為ITS1、ITS4，其序列分別為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′、5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。首先挑取1個(gè)單一菌落接于1 mL無菌水中并打勻制成菌懸液。25 μL PCR反應(yīng)體系：8.5 μL超純水，各1 μL正反向引物，12.5 μL PCR Supermix，2 μL待測(cè)菌懸液。PCR擴(kuò)增體系：95 ℃ 10 min；95 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增的DNA片段，檢測(cè)后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。利用Bioedit對(duì)序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，并在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上提交序列進(jìn)行分析，用Clustal W軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并用軟件Mega 5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.3 低醇桑椹酒的制備

將菌株及活性酵母接到桑椹汁(總糖含量為140 g/L，加入濃度為120 mg/L的偏重亞硫酸鉀)中，于25 ℃發(fā)酵1周后過濾進(jìn)行18 ℃后酵1周，然后過濾殺菌，測(cè)定其理化指標(biāo)、揮發(fā)性香氣成分，并進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.1 理化指標(biāo)測(cè)定 乙醇度、總糖含量(以葡萄糖計(jì))、總酸含量(以蘋果酸計(jì))的測(cè)定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總花青素含量的測(cè)定采用pH示差法[11]；總多酚含量的測(cè)定采用福林酚比色法[12]；總黃酮含量的測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)法[13]。

1.3.2 桑椹酒香氣測(cè)定 桑椹酒香氣萃取方法：取5 mL樣品，加入15 mL頂空瓶中，同時(shí)添加1.0 g NaCl和適量內(nèi)標(biāo)物正丙醇，放入圓柱形磁力攪拌子，蓋緊帶內(nèi)墊的瓶蓋，于40 ℃加熱平衡 10 min，然后將萃取針頭插入頂空瓶中，使之與液面保持 1.0～1.5 cm距離，萃取30 min，磁力攪拌速度為 800 r/min。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometer，簡(jiǎn)稱GC-MS)參數(shù)條件：(1)色譜條件。色譜柱DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，萃取頭解析 5 min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣(He)流量為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。程序升溫：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持7 min。質(zhì)譜條件：5973型四極桿質(zhì)譜儀，接口溫度為250 ℃，電子轟擊(EI)離子源，電子能量為70 eV，電子倍增器電壓為1 353 V，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍為33～450 amu。

(2)定性分析。數(shù)據(jù)收集采取譜庫檢索法，用HP化學(xué)工作站軟件對(duì)照NIST98庫進(jìn)行對(duì)比，成分先由譜庫初步鑒定，對(duì)正反匹配度大于800的物質(zhì)予以確認(rèn)，再結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)進(jìn)行定性[14]。

1.3.3 桑椹酒感官評(píng)價(jià)方法 以GB/T 10220—2012《感官分析 方法學(xué) 總論》和GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》為依據(jù)，參考袁小單的方法[15]制定低醇桑椹酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，詳見表1。由10名具有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的人員對(duì)桑椹酒的外觀、香氣、口感、總體接受程度進(jìn)行等級(jí)感官評(píng)定，1分表示非常不喜歡；2分表示不喜歡；3分表示既喜歡也不喜歡；4分表示喜歡；5分表示非常喜歡。根據(jù)各項(xiàng)得分計(jì)算總得分，求取平均值作為相應(yīng)得分。

表1 桑椹酒感官評(píng)價(jià)要求

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0、Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

從桑椹自然發(fā)酵液中篩選出具有酵母菌落特征和細(xì)胞特征的菌株22株，編號(hào)為Z1～Z22，從復(fù)合奶酪菌種中分離得到3株菌株，編號(hào)為D1、D2、D3，共計(jì)25株，其中不發(fā)酵的菌株3株，剩下的22株菌株的乙醇度及聞香評(píng)分結(jié)果見表2。可以看出，乙醇度在1%～7%之間的菌株有10株，即為符合篩選目標(biāo)的菌株，通過聞香打分，淘汰掉得分低于70分的菌株，篩選出4株得分較高的菌株進(jìn)行鑒定，其編號(hào)分別為Z5、Z8、Z9、D1。

表2 不同菌株的乙醇度及聞香評(píng)分結(jié)果

注：不作主要研究的菌株編號(hào)及評(píng)分以“—”表示。

2.2 菌株的鑒定

對(duì)篩選出來的4株菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，菌株D1的菌落特征為邊緣整齊、奶油狀、光滑凸起、灰白色，在顯微鏡下呈卵圓形，出芽生殖，Z5菌落為白色，呈奶油狀光滑，Z8和Z9菌落干燥，邊緣不整齊，呈現(xiàn)灰白色。相關(guān)菌株的DNA序列比對(duì)結(jié)果見表3，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，分別可將菌株D1、Z5歸為乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，將Z8、Z9歸為發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)。

表3 菌株的鑒定結(jié)果

2.3 不同酵母發(fā)酵低醇桑椹汁的基本指標(biāo)檢測(cè)及分析

桑椹含有豐富的花青素、多酚、黃酮類物質(zhì)等活性成分，具有抗氧化等功能[16]，而在桑椹發(fā)酵的過程中，其活性成分如花青素含量會(huì)由于光、溫度、金屬離子、pH值等因素而降低，使其功效受到一定的影響[17-18]。

由表4可知，4種桑椹酒的乙醇度存在顯著差異，其中Z5產(chǎn)乙醇量最低，為2.87%，AQ1發(fā)酵酒的乙醇度顯著高于其他酵母。對(duì)于活性成分含量來說，AQ1發(fā)酵酒的花青素含量最高，可能是由于花青素易溶于乙醇；Z8發(fā)酵酒的花青素含量最低。D1發(fā)酵酒的總多酚含量最高，為1.768 2 mg/mL，與Z5、Z8、AQ1發(fā)酵酒間總多酚含量具有顯著差異，不同酵母發(fā)酵的桑椹酒多酚含量存在一定差異，一方面是由不同酵母對(duì)酚類物質(zhì)的吸附作用不同引起的[19]，另一方面是由發(fā)酵過程中各種多酚不同程度的氧化、水解、聚合而引起的[20]。D1發(fā)酵的桑椹酒總黃酮含量與Z5發(fā)酵酒的總黃酮含量相比其他酵母發(fā)酵的桑椹酒總黃酮含量差異顯著，可能與不同酵母在發(fā)酵代謝過程中黃酮類物質(zhì)自身含有的酚羥基和羰基的氧化、聚合作用程度不同有關(guān)[21]。

表4 不同酵母發(fā)酵桑椹酒的指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。表6同。

2.4 不同酵母發(fā)酵桑椹酒的揮發(fā)性香氣成分分析

果酒的香氣是評(píng)價(jià)果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，Lema等研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌是影響葡萄酒香氣成分的重要因素[22]。由表5可知，從4種菌株發(fā)酵的桑椹酒中共檢出49種主要香氣物質(zhì)，包括11種醇類、26種酯類、7種酸類、2種酮類、3種醛類，其中含量較高的香氣成分是異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯，這與孫玉霞等采用葡萄酒活性干酵母發(fā)酵所得桑椹酒的主要揮發(fā)性香氣成分大部分相同[23]，但是低醇酒香氣成分的酯類物質(zhì)乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯含量要高于醇類物質(zhì)異戊醇、苯乙醇，這一點(diǎn)與普通酵母發(fā)酵桑椹酒相反。

不同酵母發(fā)酵的桑椹酒間揮發(fā)性物質(zhì)種類、含量存在一定差異，由表5可知，D1發(fā)酵酒中檢出的醇類物質(zhì)最豐富，為11種，但AQ1發(fā)酵酒中的醇類含量明顯高于其他酵母，其中含量相對(duì)較高的醇類有異戊醇、苯乙醇等。異戊醇屬于高級(jí)醇，是由酵母分解異亮氨酸生成的，具有苦杏仁味、澀味[24]，在AQ1發(fā)酵酒中含量最高，其次是在D1發(fā)酵酒中。4種酵母發(fā)酵的桑椹酒中產(chǎn)生的酯類物質(zhì)種類分別為22、10、16、15種，在D1發(fā)酵酒中最豐富，在Z5發(fā)酵酒中最少，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯含量相對(duì)較高，對(duì)桑椹酒香氣貢獻(xiàn)較大，在AQ1發(fā)酵酒中酯類含量最低。D1發(fā)酵酒中獨(dú)有的異戊酸乙酯、乙酸苯甲酯以及高含量的苯乙酸乙酯等具有愉快的甜香、蜜香、香蕉香[25]。乙酸苯乙酯具有舒適的蜜香、花香[25]，在Z8發(fā)酵酒中含量最高，與正丙醇含量的比值為28.81，其次是在D1發(fā)酵酒中，與正丙醇含量的比值為21.59。乙酸是4種桑椹酒中共有的酸類，可賦予酒醋酸味。在Z8發(fā)酵酒中檢測(cè)到具有腐敗味、不愉快的脂肪味[26]的異戊酸、辛酸、癸酸，給果酒帶來不愉快的氣味。除此之外，在D1、Z8、AQ1發(fā)酵酒中檢出醛類物質(zhì)，少量的壬醛、癸醛會(huì)使果酒具有柑橘香和甜橙香。但在AQ1發(fā)酵酒中檢測(cè)出乙醛，會(huì)給果酒帶來刺激氣味[25]。

表5 不同酵母發(fā)酵桑椹酒的主要香氣成分

序號(hào)化合物名稱與內(nèi)標(biāo)物含量的比值D1Z5Z8AQ124 乙酸己酯——0.05—25 醋酸異辛脂——0.02—26 辛酸乙酯0.05—0.080.0627 壬酸乙酯0.09———28 癸酸乙酯0.080.080.560.4529 丁二酸二乙酯0.03———30 苯甲酸乙酯0.150.160.190.0531 乙酸苯甲酯0.03———32 苯乙酸乙酯0.110.060.100.0833 乙酸苯乙酯21.594.1128.813.7834 己酸-2-苯乙酯0.15—0.32—35 丙酸苯乙酯0.39—0.14—36 異戊酸苯乙酯———0.0837 棕櫚酸乙酯0.03—0.06—酸類物質(zhì)0.432.011.481.3638 乙酸0.352.010.760.4939 異丁酸0.04———40 異戊酸——0.07—41 2-甲基己酸0.04——0.0242 辛酸——0.230.8543 壬酸——0.16—44 癸酸——0.26—酮類物質(zhì)—0.180.030.1145 3-羥基-2-丁酮—0.100.03—46 大馬士酮—0.08—0.11醛類物質(zhì)0.04—0.100.2147 乙醛———0.1248 壬醛0.02—0.050.0949 癸醛0.02—0.05—

注：“—”表示未檢測(cè)到該香氣成分。

2.5 不同酵母發(fā)酵桑椹酒的感官評(píng)定結(jié)果

由表6可知，D1、Z5、AQ1發(fā)酵的桑椹酒外觀易被接受和喜歡，三者之間無顯著差異，但三者與Z8發(fā)酵酒存在顯著差異，Z8發(fā)酵酒顏色欠佳可能與其發(fā)酵過程中總花青素?fù)p耗較大有關(guān)；對(duì)于香氣來說，D1發(fā)酵酒與Z5、Z8、AQ1發(fā)酵酒存在顯著差異，D1發(fā)酵酒的果香、醇香平衡，Z8發(fā)酵酒的整體花香突出，但是果香弱，這可能與其香氣中酯類物質(zhì)如乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯含量較高有關(guān)，AQ1發(fā)酵酒由于乙醇含量高而使整體醇香濃，果香較淡；在口感方面，D1發(fā)酵酒口感柔和爽口，AQ1發(fā)酵酒醇感突出、平淡，Z8發(fā)酵酒口感酸苦?？傮w來說，D1菌株更適合用于發(fā)酵低醇桑椹酒。

3 結(jié)論

從桑椹自然發(fā)酵液和奶酪復(fù)合菌種中進(jìn)行分離得到產(chǎn)乙醇能力較低的4株菌株D1、Z5、Z8、Z9，經(jīng)過18S rDNA序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，判斷菌株D1、Z5分別為Kluyveromyceslactis、Hanseniasporauvarum，Z8、Z9為Pichia

fermentans。通過測(cè)定各菌株發(fā)酵桑椹酒的各項(xiàng)指標(biāo)、香氣成分及感官評(píng)價(jià)，表明不同酵母發(fā)酵的桑椹酒品質(zhì)存在一定差異，其中D1發(fā)酵酒較其他酵母發(fā)酵酒具有較高含量的總多酚、總黃酮等活性成分，香氣成分種類豐富，醇類、酯類對(duì)香氣的貢獻(xiàn)較大。感官評(píng)價(jià)分析表明，D1發(fā)酵酒果香、醇香平衡，口感柔和爽口，較其他酵母來說更適合用于發(fā)酵桑椹酒。