托盤(pán)根多糖初步純化及其體外抗氧化活性研究

楊秀東，張嬪妹，張 艷，張 揚(yáng)，崔 浩，周鴻立

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學(xué)院 圖書(shū)館，吉林 吉林 132022)

薔薇科懸鉤子屬(Rubus L.)植物在我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥中具有非常廣泛的應(yīng)用，本屬植物的入藥部位很多，果實(shí)、種子、根及葉均可入藥，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、清熱解毒、止血止痛和固腎澀精等作用[1].如覆盆子(R.chingii Hu)的主要化學(xué)成分包括皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾體和生物堿等，用于治療遺尿尿頻、陽(yáng)痿早泄、遺精滑精等癥[2].山莓(R.corchorifoliu L.)全株含黃酮、鞣質(zhì)、香豆素、皂苷等化學(xué)成分，具有祛風(fēng)除濕、消腫解毒、助陽(yáng)明目、治療腹瀉等功效[3].

托盤(pán)根為薔薇科懸鉤子屬植物托盤(pán)(RubuscrataegifoliusBunge.)的干燥根.作為傳統(tǒng)中藥，民間用于治療慢性肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4].國(guó)內(nèi)外對(duì)托盤(pán)根化學(xué)成分和藥理作用的研究較少，其醇提物具有抗組織過(guò)氧化作用[5,6]，對(duì)小鼠肉瘤S180，小鼠艾氏腹水瘤(EAC)，HepA肝癌及Lewis肺癌等腫瘤具有明顯的抑制作用[7,8].同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)托盤(pán)根醇提物能夠抑制小鼠蛋清性足腫脹和二甲苯性耳腫脹，并且能夠抑制腹腔毛細(xì)血管的通透性，加快消退角叉菜膠引起的足腫脹，減少炎性肉芽腫的增生[9].Sun等還研究了托盤(pán)根不同提取物的肝保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物比總提取物和正丁醇提取物具有更強(qiáng)的抗氧化作用和肝保護(hù)作用[10].其水煎劑能夠通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化作用，減輕糖尿病引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化，發(fā)揮抗氧化作用，對(duì)糖尿病大鼠臟器具有修復(fù)作用，促進(jìn)胰島功能恢復(fù)從而發(fā)揮其降血糖作用[11].已有報(bào)道對(duì)托盤(pán)根多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及粗多糖的α-葡萄糖苷酶的抑制作用進(jìn)行了報(bào)道[12,13]，本研究對(duì)托盤(pán)根多糖進(jìn)行了提取、分離和初步純化，并評(píng)價(jià)純化多糖的體外抗氧化活性，為托盤(pán)根多糖的深入研究與開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

托盤(pán)根：采集自吉林市郊區(qū)，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)李勇教授鑒定為薔薇科懸鉤子植物托盤(pán)(Rubus crataegiflolius Bunge.)的干燥根.DEAE：大連美侖生物技術(shù)有限公司；葡萄糖對(duì)照品：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；DPPH：上海如吉生藥科技有限公司；2,2′-聯(lián)氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鄰苯三酚、過(guò)硫酸鉀：上海晶純生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純.

TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SpectraMax Plus384型酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-118型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA2004N型分析天平：上海精密科學(xué)股份有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市正基儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 托盤(pán)根多糖的提取

托盤(pán)根清洗后置于烘箱干燥至恒重，粉碎，過(guò)40目篩.稱(chēng)取托盤(pán)根粗粉250 g，加入2 500 mL水浸泡過(guò)夜，加熱回流2 h，提取2次，過(guò)濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至原體積1/5，加入95%乙醇至醇濃度為80%，于4 ℃靜置過(guò)夜，4 000 rpm離心15 min，棄去上清液，得托盤(pán)根粗多糖.

1.2.2 托盤(pán)根粗多糖的純化

稱(chēng)取上述處理多糖粉末1 g，配制成0.5 g/mL的水溶液，過(guò)濾后加入至DEAE-52層析柱中，依次用水、0.1和0.2 mol/L的NaCl溶液各100 mL洗脫，流速為1.5 mL/min，每6 min收集一個(gè)餾分.用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，繪制洗脫曲線.

1.2.3 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定托盤(pán)根樣品中的多糖含量，以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖為質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm；以小牛血清白蛋白為對(duì)照品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量[14].

1.2.4 體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 DPPH清除率實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法[15]，并稍作修改，取托盤(pán)根純化多糖RCP-1和RCP-2用純化水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液備用.取樣品溶液100 μL于96孔板中，加入濃度為0.16 mmol/L DPPH甲醇溶液.混合均勻后室溫避光放置30 min，在517 nm下測(cè)定吸光度.空白對(duì)照用純化水代替樣品溶液，每份樣品平行操作三次.其清除率計(jì)算公式如下：

清除率(%)=[A空白-A樣品]/A空白×100

式中：A空白為空白樣品的吸光度，A樣品為測(cè)試樣品的吸光度.

1.2.4.2 超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)

超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法[16]，并稍作修改.托盤(pán)根純化多糖RCP-1和RCP-2用純化水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液備用.取200 μL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液，20 μL不同濃度樣品溶液和20 μL純化水(空白對(duì)照)，25 ℃反應(yīng)20 min.繼續(xù)加入20 μL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分振蕩后，在酶標(biāo)儀中于325 nm處測(cè)定1 min和4 min時(shí)的吸光度.其清除率計(jì)算公式如下：

清除率(%)=[A1-A2]/A1×100

式中A1為鄰苯三酚自氧化率；A2為加入樣品的鄰苯三酚自氧化率.

1.2.4.3 ABTS清除率實(shí)驗(yàn)

清除ABTS自由基的測(cè)定是參照文獻(xiàn)[14]方法，并稍作修改.托盤(pán)根純化多糖RCP-1和RCP-2用純化水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液備用.取質(zhì)量濃度7 mmol/L ABTS溶液5 mL，加入88 μL濃度為140 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合，在室溫避光條件放置過(guò)夜，反應(yīng)完成后用水稀釋20～40倍，使其在734 nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.7±0.02，即得到ABTS+工作液.取不同濃度的樣品溶液10 μL于96孔板中，加入190 μL的ABTS+工作液，空白用純化水代替樣品溶液，不同濃度的Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照.室溫避光放置6 min，于734 nm下測(cè)定其吸光度.每份樣品平行操作3次.其清除率計(jì)算公式如下：

清除率(%)=[A空白-A樣品]/A空白×100%

式中：A空白為空白樣品的吸光度，A樣品為測(cè)試樣品的吸光度.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 托盤(pán)根多糖的分離純化

采用水提醇沉法提取托盤(pán)根多糖，經(jīng)濃縮干燥后的托盤(pán)根粗多糖5.27 g，苯酚-硫酸法測(cè)定托盤(pán)根粗多糖中多糖含量為14.24%.經(jīng)Sevage法脫蛋白后，托盤(pán)根粗多糖中多糖含量為42.55%，透析后多糖含量為50.64%.上述純化后的托盤(pán)根多糖用DEAE-52陰離子交換柱層析純化，得到兩個(gè)餾分，分別為水洗脫和0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到，分別命名為RCP-1(20.7 mg)和RCP-2(113.4 mg)，冷凍干燥，兩個(gè)純化后多糖為類(lèi)白色粉末，經(jīng)測(cè)定其多糖含量分別為80.66%和82.15%，且兩個(gè)純化多糖中未檢測(cè)出蛋白質(zhì).

試管號(hào)圖1 托盤(pán)根多糖的DEAE-52洗脫曲線

2.2 托盤(pán)根純化多糖體外抗氧化性活性

2.2.1 托盤(pán)根純化多糖對(duì)DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其在乙醇溶液中具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析，是一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏且可行的評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化能力的方法.由圖2可知，不同濃度的托盤(pán)根純化多糖對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除作用，隨著樣品濃度的增加，對(duì)DPPH自由基清除率越高.在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，RCP-2對(duì)DPPH的清除率明顯高于RCP-1.在濃度為0.025,0.05,0.1和0.2 mg/mL時(shí)，RCP-2對(duì)DPPH的清除率分別為25.35%，31.28%，52.64%和67.88%.

質(zhì)量濃度/(mg/mL)圖2 托盤(pán)根純化多糖對(duì)DPPH自由基清除率

注：*表示相同濃度下兩個(gè)樣品作用的差異顯著(p<0.05)；圖3，圖4同.

質(zhì)量濃度/(mg/mL)圖3 托盤(pán)根純化多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率

質(zhì)量濃度/(mg/mL)圖4 托盤(pán)根純化多糖對(duì)ABTS自由基清除率

2.2.2 托盤(pán)根純化多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基可作為多數(shù)氧自由基的母體，在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成其他自由基.不僅其衍生的自由基會(huì)毒性細(xì)胞，而且超氧陰離子自由基本身也有毒害作用.由圖4可知托盤(pán)根粗多糖對(duì)超氧陰離子具有較好的清除作用，其清除率隨濃度增大而增加，且RCP-2對(duì)超氧陰離子的清除作用明顯高于RCP-1(p<0.05)，當(dāng)濃度為0.2 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到了68.57%，清除超氧陰離子的IC50值為0.12 mg/mL，而RCP-1的IC50值高于0.2 mg/mL.

2.2.3 托盤(pán)根純化多糖對(duì)ABTS自由基清除率

ABTS法是基于分光光度法來(lái)測(cè)定樣品的抗氧化活性，ABTS試劑在氧化劑作用下會(huì)形成綠色的ABTS自由基，在抗氧化物存在時(shí)ABTS自由基的產(chǎn)生會(huì)被抑制.此法具有操作簡(jiǎn)單、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化活性常用的一種自由基.圖4顯示托盤(pán)根純化多糖RCP-1和RCP-2對(duì)ABTS自由基的清除作用，兩個(gè)多糖在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)ABTS均有一定的清除作用，其清除作用隨實(shí)驗(yàn)濃度的增加而增大，在實(shí)驗(yàn)濃度為0.2 mg/mL時(shí)，RCP-1和RCP-2對(duì)ABTS的清除率分別為39.03%和58.03%.同時(shí)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，RCP-2對(duì)ABTS自由基的清除作用明顯高于RCP-1(p<0.05).

3 結(jié) 論

植物多糖是構(gòu)成生物體的基本物質(zhì)之一，多有10個(gè)以上的單糖分子通過(guò)糖苷鍵聚合而成，在有機(jī)體中參與多種生命活動(dòng).近年來(lái)，多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中最熱門(mén)的領(lǐng)域之一，其在生命過(guò)程中的重要生理功能和其廣泛的應(yīng)用正在不斷被挖掘，是天然藥物和保健品研發(fā)中的重要組成部分[17].大量研究表明，天然藥物中的多糖具有顯著的抗氧化活性，多糖類(lèi)成分能夠清除自由基、提高抗氧化酶的活性以及減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出多種途徑的抗氧化作用，其抗氧化作用也是其生物活性的作用機(jī)制之一[18].本研究采用水提醇沉法對(duì)托盤(pán)根多糖進(jìn)行提取，通過(guò)Sevage法脫蛋白及透析法進(jìn)行托盤(pán)根多糖的初步純化除雜，最后通過(guò)DEAE-52纖維素離子交換柱色譜進(jìn)行純化，得到了2種較純的托盤(pán)根多糖組分.其體外抗氧化活性表明，兩個(gè)組分對(duì)DPPH、超氧陰離子和ABTS均有較好的清除作用，其中0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到的多糖RCP-2的體外抗氧化活性明顯高于RCP-1.兩個(gè)純化多糖的結(jié)構(gòu)還未鑒定和解析，其體外抗氧化活性與分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性還需要進(jìn)一步研究.