玉米須抗疲勞口服液衛(wèi)生學(xué)研究

田海蘋，崔 浩,2，李 兵，周鴻立,2*

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林省農(nóng)業(yè)資源綜合開(kāi)發(fā)與利用工程研究中心，吉林 吉林 132000)

目前適合青少年能量、營(yíng)養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)的飲品非常多，但適合中老年人以及易疲勞人群的飲料產(chǎn)品比較少[1]，玉米須抗疲勞口服液比碳酸飲料解渴、爽口，比普通的飲料清香淡雅，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全性評(píng)價(jià)認(rèn)為玉米須對(duì)人體不會(huì)產(chǎn)生急性、亞慢性毒性危害[2].玉米須成本低廉，價(jià)格便宜[3]，具有抗疲勞、抗氧化等功能[4,5]，玉米須抗疲勞口服液在價(jià)格上將會(huì)占有一定的優(yōu)勢(shì)，適合廣大群眾購(gòu)買，中老年人糖尿病、中高脂血癥患者越來(lái)越多[6]，所以玉米須抗疲勞口服液具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展空間.

衛(wèi)生學(xué)研究能夠反映具有抑菌成分的中藥制劑染菌程度及操作者和生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生情況[7].其中微生物限度的檢驗(yàn)是衛(wèi)生學(xué)中必要的部分[8].金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素可以引起食物中毒，沙門氏菌可以引起霍亂，根據(jù)國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，食品中不得檢出金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等致病菌[9].

玉米須抗疲勞口服液為預(yù)申報(bào)保健食品，所以微生物限量操作及限量應(yīng)符合GB29921-2013中相應(yīng)類屬食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定.玉米須抗疲勞口服液處方中含有的沙棘等有效成分有較強(qiáng)的抑菌活性[10]，為準(zhǔn)確檢驗(yàn)出制劑受污染的情況，分別采用鏡檢、沙門氏菌血清學(xué)鑒定進(jìn)行了微生物限度檢查的驗(yàn)證[11].本實(shí)驗(yàn)研究為確定口服液的保質(zhì)期提供重要依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

玉米須抗疲勞口服液(玉米須、沙棘、山楂、甘草、甜味劑組成)，吉林黃梔花藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)；牛肉粉、月示胨、乳糖、瓊脂，食品級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；胰蛋白胨，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；酵母浸膏，分析純，天津市北方化玻購(gòu)銷中心；丙酮酸鈉，分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；卵黃鹽，分析純，哈爾濱市新春化學(xué)試劑廠；沙黃，分析純，哈爾濱市新春化學(xué)試劑廠；煌綠，分析純，南京建成生物工程研究所.

JD-CJ-2A型無(wú)菌操作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HX0100135-ZCWS型高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FYL-YS-50L型培養(yǎng)箱，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HX0100135-ZCWS型全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，天津市泰斯特儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

需檢樣品共三種如下：(1)玉米須抗疲勞口服液0天，室溫自然環(huán)境放置0天；(2)玉米須抗疲勞口服液6個(gè)月，在穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，按照穩(wěn)定性試驗(yàn)中加速試驗(yàn)的條件，設(shè)置溫度40±2 ℃，相對(duì)濕度75%±5%放置6個(gè)月；(3)玉米須抗疲勞口服液36個(gè)月，按照穩(wěn)定性試驗(yàn)的長(zhǎng)期試驗(yàn)條件，在室溫(25±2 ℃)，相對(duì)濕度60%±10%放置36個(gè)月.

在進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，需要對(duì)所采用的檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[12]；最終根據(jù)GB 4789-2016相關(guān)規(guī)定確定需要對(duì)該類屬食品進(jìn)行金黃色葡萄球菌數(shù)及沙門氏菌數(shù)測(cè)定.

1.2.1 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

1.2.1.1 檢驗(yàn)程序驗(yàn)檢

根據(jù)圖1對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)：

圖1 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序

1.2.1.2 樣品的處理

吸取25 mL玉米須抗疲勞口服液至盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中，振蕩混勻.

1.2.1.3 血瓊脂平板

血瓊脂平板見(jiàn)表1.

表1 培養(yǎng)基成分(pH 7.5±0.2)

制法：加熱溶化瓊脂，冷卻至50 ℃，以無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板.

1.2.1.4 Baird-Parker瓊脂平板制備

根據(jù)GB29921中的方法制作Baird-Parker瓊脂平板[13].

1.2.1.5 初步鑒定方法

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)、菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶.當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感.有時(shí)可見(jiàn)到不分解脂肪的菌株，除沒(méi)有不透明圈和清晰帶外，其他外觀基本相同.從長(zhǎng)期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其黑色常較典型菌落淺些，且外觀可能較粗糙，質(zhì)地較干燥.在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色(有時(shí)為白色)，菌落周圍可見(jiàn)完全透明溶血圈.挑取上述可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn).

1.2.1.6 確證鑒定

染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，直徑約為0.5～1 μm.

1.2.2 沙門氏菌的檢驗(yàn)

沙門氏菌在SS培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)特征：無(wú)色至淡黃色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色.根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版二部附錄ⅩⅨ O微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，對(duì)沙門氏菌進(jìn)行考察.

1.2.2.1 檢驗(yàn)程序

根據(jù)圖2對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢驗(yàn)：

圖2 沙門氏菌檢驗(yàn)程序

1.2.2.2 樣品的處理

無(wú)菌操作稱取25 g/mL樣品，置于盛有225 mL緩沖蛋白胨水(BPW)的無(wú)菌錐形瓶?jī)?nèi)，以8 000～10 000 r/min均質(zhì)1～2 min，振蕩混勻.調(diào)整pH，用1 mol/mL無(wú)菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2.無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500 mL錐形瓶?jī)?nèi)，于36±1 ℃培養(yǎng)8～18 h.

1.2.2.3 增菌

輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物，移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL四氯磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液內(nèi)，于42±1 ℃培養(yǎng)18～24 h.同時(shí)，另取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液內(nèi)，于36±1 ℃培養(yǎng)18～24 h.

1.2.2.4 沙門氏菌培養(yǎng)及確證鑒定

將上述培養(yǎng)物分別劃線于沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養(yǎng)基(SS瓊脂)的平板上培養(yǎng)18～24 h(必要時(shí)延長(zhǎng)40～48 h).若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落不同于沙門氏菌的菌落特征，判斷供試品未檢出沙門氏菌.

若平板上生長(zhǎng)的菌落與沙門氏菌落特征相似，需要用接種針挑選2～3個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行穿刺接種，培養(yǎng)18～24 h，如果斜面未見(jiàn)紅色，底層未見(jiàn)黃色；或斜面為黃色、底層無(wú)黑色，判供試品未檢出沙門氏菌.否則進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)，確認(rèn)沙門氏菌.

2 結(jié)果與討論

2.1 血瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

血瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告見(jiàn)圖3～圖6.

(A：試驗(yàn)0個(gè)月樣品；B：試驗(yàn)6個(gè)月樣品；C：試驗(yàn)36個(gè)月樣品)圖3 血瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

圖4 血平板A圖鏡下形態(tài)圖5 血平板C圖鏡下形態(tài)

(A：試驗(yàn)0個(gè)月樣品；B：試驗(yàn)6個(gè)月樣品；C：試驗(yàn)36個(gè)月樣品)圖6 增菌后的形態(tài)

結(jié)果：圖3中A、B、C肉眼未看出金黃色葡萄球菌的存在，圖C肉眼可以看出平板上長(zhǎng)了大量的菌落；圖4未見(jiàn)金黃色葡萄球菌，但有少量的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌；圖5可明顯的觀察出大量的革蘭氏陽(yáng)性桿菌；圖6用肉眼可以清晰的看出三者均長(zhǎng)出了菌落，觀察其鏡下形態(tài)均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌.未檢出金黃色葡萄球菌.

2.2 Baird-Parker瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

結(jié)果：圖7中Baird-Parker瓊脂平板的金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告，三種樣品均未見(jiàn)金黃色葡萄球菌以及其他菌落.

(A：試驗(yàn)0個(gè)月樣品；B：試驗(yàn)6個(gè)月樣品；C：試驗(yàn)36個(gè)月樣品)圖7 Baird-Parker瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

2.3 沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養(yǎng)基(SS瓊脂)平板沙門氏菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

結(jié)果：圖8中可以清晰的看出，并未檢出沙門氏菌.

(A：試驗(yàn)0個(gè)月樣品；B：試驗(yàn)6個(gè)月樣品；C：試驗(yàn)36個(gè)月樣品)圖8 SS培養(yǎng)基沙門氏菌檢驗(yàn)報(bào)告

3 結(jié) 論

玉米須抗疲勞口服液在血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、SS瓊脂平板的0、6、36個(gè)月微生物限度檢查中，均未檢出金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，在血平板的36個(gè)月檢驗(yàn)中，檢驗(yàn)出了革蘭氏陽(yáng)性桿菌，但穩(wěn)定性試驗(yàn)制定口服液的保質(zhì)期為20個(gè)月，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中需檢菌為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，所以玉米須抗疲勞口服液衛(wèi)生學(xué)符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).