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    通江產(chǎn)辣木葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化及含量測定

    2018-09-06 11:21:38馬裔寒李霞輝
    中國獸藥雜志 2018年8期
    關(guān)鍵詞:通江辣木木葉

    劉 宇,俸 丹,陳 云,朱 蕊,馬裔寒,李霞輝,舒 剛

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 610000)

    辣木(MoringaoleiferaLam.)屬小喬木植物,原產(chǎn)于印度,因具有耐干旱、生長迅速、營養(yǎng)豐富的特點(diǎn),有“奇跡之樹”之稱[1-2]。大量試驗(yàn)表明,辣木是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料、健康綠色的保健食品、藥食同源的植物[3],在天然產(chǎn)物越來越受關(guān)注的當(dāng)今,進(jìn)行辣木的研究具有較大的價(jià)值。辣木的葉為三回羽狀復(fù)葉,小葉卵形、短橢圓或橢圓,因其資源豐富、采集方便、加工簡單,所以是辣木研究最多且最早的部位,我國衛(wèi)生部在2012年批準(zhǔn)辣木葉為新資源食品[4-5]。目前,國外開展的辣木葉研究中發(fā)現(xiàn)辣木葉中含有豐富的藥用成分和營養(yǎng)物質(zhì),如黃酮類物質(zhì)、多糖和水溶性蛋白等,并且具有多種生物活性,包括降低膽固醇、抗糖尿病、抗胃潰瘍和抗腫瘤等,同時(shí)用于心血管、炎癥和肝臟疾病的治療[6-7]。黃酮類化合物具有多種生物學(xué)功能,如清除自由基、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤和抗癌等,且對于肝病、心血管疾病均有一定的療效,對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制或促進(jìn)的作用,對畜禽生產(chǎn)也有良好的促進(jìn)功能[8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道,辣木葉的醇提物或水提物有顯著的生物活性,正是因?yàn)樘崛∫褐泻胸S富的黃酮類化合物和多酚類[10]。黃酮類化合物的諸多生物活性促使其在食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)中均有廣泛的應(yīng)用[11]。

    1 材 料

    1.1 主要藥品 試驗(yàn)所用的8、9、10月的辣木葉均采自于四川省通江,經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系李麗霞老師鑒定為辣木屬植物。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購自成都瑞芬思生物科技有限公司)、分析純無水乙醇、分析純亞硝酸鈉、分析純硝酸鋁、分析純氫氧化鈉。

    1.2 主要儀器 101A-4型電熱鼓風(fēng)干燥箱、RH-800型高速多功能粉碎機(jī)、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、ESJ200-4A電子天平(北京Sartorius天平有限公司)、SC-3614低速離心機(jī)、UV2000型紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)

    2 方法與結(jié)果

    2.1 辣木葉總黃酮的提取

    2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照王苗苗[12]繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)各濃度蘆丁對應(yīng)的吸光值,計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=10.308X-0.0054,相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

    2.1.2 辣木葉總黃酮的提取流程 干燥→粉碎→浸漬提取→離心→含量測定

    將新鮮的辣木葉放于干燥箱中干燥24 h,干燥后的辣木葉用粉碎機(jī)粉碎并過60目篩。準(zhǔn)確稱取1 g辣木葉粉放入燒杯中,加入磁力攪拌子和一定量配置好的乙醇溶液,用保鮮膜將燒杯密封,防止乙醇溶液揮發(fā),待磁力攪拌器達(dá)到需要的溫度后,將裝好藥品的燒杯放入磁力攪拌器的水浴環(huán)境中,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速進(jìn)行提取,并計(jì)時(shí)。將提取液轉(zhuǎn)移到離心管中,于4000 r/min下離心10 min。離心完畢后,取離心管中的上清液于容量瓶中配置待測溶液,按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的方法測定吸光度,計(jì)算總黃酮提取率。

    2.1.3 辣木葉總黃酮提取率的測定 準(zhǔn)確吸取1 mL辣木葉總黃酮的提取液,放入10 mL的容量瓶中,先加入 0.3 mL 5% NaNO2溶液,混勻后靜置6 min;加入0.3 mL10%Al(NO3)3溶液,混勻并靜置6 min;加入4 mL 4% NaOH溶液搖勻,用提取溶劑將其定容至刻度,混勻后靜置15 min,按照制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度。將測得的吸光度值帶入回歸方程中,計(jì)算出原提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度(C),測量得到辣木提取液體積(V),并計(jì)算出辣木葉中總黃酮的提取率。

    辣木葉中總黃酮提取率%=C×V×N÷M×100

    其中:C為原提取液總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為提取液的總體積(mL);N為稀釋倍數(shù);M為稱取的辣木葉粉質(zhì)量(mg)。

    2.2 單因素試驗(yàn) 在保持溫度、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間一致的條件下,分別考察不同乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、不同溶劑用量(20倍、25倍、30倍、35倍、40倍)、不同提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、不同提取溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)四個(gè)因素對辣木葉總黃酮得率的影響情況,確定四個(gè)單因素的適宜水平。

    圖1 溫度對辣木葉總黃酮提取率的影響Fig 1 temperature on the total flavonoids Moringa leaf extraction rate

    圖2 乙醇濃度對辣木葉總黃酮提取率的影響Fig 2 ethanol concentration on the total flavonoids Moringa leaf extraction rate

    圖3 料液比對辣木葉總黃酮提取率的影響Fig 3 Effect of liquor-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Moringa leaves

    圖4 提取時(shí)間對辣木葉總黃酮提取率的影響Fig 4 extraction time on the total flavonoids Moringa leaf extraction rate

    2.2.1 溫度對辣木葉總黃酮提取率的影響 由圖1可知,隨著提取溫度的升高,辣木葉總黃酮提取率呈上身的趨勢,在60 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大,因?yàn)闇囟壬?,有利于有效成分的溶出。?dāng)提取溫度過高時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致大量總黃酮化合物之外的醇溶性雜質(zhì)也溶解加速,使辣木葉總黃酮在乙醇溶液中的溶解度降低,因此導(dǎo)致辣木葉總黃酮提取率降低。此外,黃酮類化合物本身易被氧化,特別是在高氧高溫的環(huán)境下,黃酮類化合物結(jié)構(gòu)更易被氧化破壞,這也在一定程度上導(dǎo)致了辣木葉黃酮類提取率降低[13]。

    2.2.2 乙醇濃度對辣木葉總黃酮提取率的影響 由圖2可知,乙醇濃度在50%到70%之間時(shí),辣木葉總黃酮提取率逐漸上升,因?yàn)辄S酮類化合物主要是以黃酮糖苷的形式存在,黃酮糖苷由糖和甙元形成,其中糖易溶于水,而甙元不易溶于水,由“相似相溶”原理可知,當(dāng)乙醇與水的比例適宜時(shí),提取率可達(dá)到最大值[14]。乙醇濃度在70%-80%之間基本持平,表明在這一范圍內(nèi)的乙醇濃度與辣木葉總黃酮的極性相似。當(dāng)乙醇濃度增加到80%后,總黃酮的提取率呈下降趨勢,因?yàn)橐掖紳舛冗^高,反而會(huì)導(dǎo)致色素、醇溶性雜質(zhì)和親脂性強(qiáng)的成分的溶出量增加,干擾因素也隨之增大,導(dǎo)致辣木葉總黃酮的提取率不升反降[15]。

    2.2.3 料液比對辣木葉總黃酮提取率的影響 由圖3可知,隨著液料比的增大,辣木葉總黃酮的提取率上升,當(dāng)液料比持續(xù)增大,提取率反而降低。因?yàn)樵龃罅弦罕瓤梢栽黾永蹦救~粉與乙醇溶劑之間的濃度差及接觸面積,黃酮類化合物向溶劑中轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散系數(shù)增大,從而使提取率增加[16]。料液比過大時(shí),與有效成分無關(guān)的雜質(zhì)也更易于溶出,導(dǎo)致提取率逐漸下降。

    2.2.4 提取時(shí)間對辣木葉總黃酮提取率的影響 由圖4可知,隨著提取時(shí)間的增加,辣木葉總黃酮的提取率呈先增大后逐漸降低的趨勢,當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大值。因?yàn)樵黾犹崛r(shí)間,有利于辣木葉總黃酮在乙醇溶液中的溶解,提高其提取率,隨著提取時(shí)間的延長,一方面會(huì)導(dǎo)致其他醇溶性雜質(zhì)也被溶解提取,阻礙黃酮類化合物的溶出,另一方面也會(huì)增加辣木葉總黃酮被氧化的可能性,導(dǎo)致提取率降低[17]。因此,需要對提取時(shí)間加以控制。

    2.3 辣木葉總黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

    2.3.1 辣木葉總黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用Design-Expert8.0.6.1軟件中的Box-Behnken design設(shè)計(jì)原理,以提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和提取溫度4個(gè)因素為自變量,總黃酮提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn),并在最優(yōu)提取條件下對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平編碼值見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)編排組合見表2。

    表1 辣木葉總黃酮提取率響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼Tab 1 Moringa leaf total flavonoid extraction response surface test factor level coding

    表2 辣木葉總黃酮提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Moringa leaf flavonoids extraction rate response surface test design and results

    續(xù)表

    2.3.2 辣木葉總黃酮提取的響應(yīng)面法優(yōu)化分析 采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析,得到以總黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸方程:Y=+2.78+0.013*A-0.11*B+0.060*C+0.037*D-0.038*A*B-0.086*A*C+0.12*A*D+0.060*B*C-0.043*B*D-3.500E-003*C*D+0.027*A2+0.15* B2-0.018*C2+0.11* D2,其中Y為總黃酮提取率(%), A為溫度(℃), B為乙醇濃度(%), C為液料比(g/mL), D時(shí)間(min) 。

    對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(表3)可知,模型P<0.05,差異顯著,說明模型對試驗(yàn)擬合情況較好,可以用該模型來預(yù)測不同提取條件下的總黃酮提取率。B、B2顯著, AD、D2顯著,說明各因素對響應(yīng)值并不僅僅是簡單的線性關(guān)系,且影響辣木葉總黃酮提取率的因素主次為:濃度(B)>時(shí)間(D)>溫度(A)>料液比(C)。為了更加直觀地反映出因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響情況,利用軟件Design-Expert8.0.6.1繪制三維響應(yīng)面圖來進(jìn)一步分析各因素和響應(yīng)值之間的相互影響關(guān)系。

    由圖5可以看出,乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對總黃酮提取率的影響表現(xiàn)為顯著水平,當(dāng)乙醇濃度和提取時(shí)間逐漸下降時(shí),辣木葉總黃酮的提取率呈上升趨勢。因此,當(dāng)選擇較低的乙醇濃度和較短的提取時(shí)間即可得到較高的總黃酮得率。

    表3 響應(yīng)面法ANOVA 分析結(jié)果Tab 3 Response surface ANOVA analysis results

    *表示差異顯著,P<0.05;**表示差異極顯著,P<0.01

    A 提取溫度與乙醇濃度 B提取溫度與料液比

    C提取溫度與提取時(shí)間 D提取濃度與料液比

    E提取濃度與提取時(shí)間 F料液比與提取時(shí)間

    2.4 試驗(yàn)驗(yàn)證及結(jié)果 利用Design-Expert8.0.6.1軟件建立的數(shù)學(xué)模型,得到1個(gè)最優(yōu)的工藝條件,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),驗(yàn)證最優(yōu)提取工藝條件的準(zhǔn)確性。驗(yàn)證結(jié)果:利用響應(yīng)面分析軟件建立數(shù)學(xué)模型,得到1個(gè)理想的工藝條件。即在料液比1∶30(g/mL)、提取時(shí)間30 min、提取溫度55 ℃ 、乙醇濃度75%的條件下,辣木葉總黃酮的理論提取率為2.919%。對理想提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證,得到辣木葉總黃酮提取率實(shí)測值可達(dá)3.018%,表明浸漬法提取辣木葉總黃酮具有一定的可行性。

    2.5 各個(gè)月份辣木葉總黃酮含量的測定 在最佳提取工藝條件下測定8、9、10月通江產(chǎn)辣木葉總黃酮含量,分析各個(gè)月份的辣木葉總黃酮含量差異,以得出辣木葉采摘的最佳時(shí)間。即在料液比1∶30 (g/mL)、提取時(shí)間30 min、提取溫度 55℃ 、乙醇濃度75%的最佳提取工藝條件下,對8、9、10月通江產(chǎn)辣木葉總黃酮含量進(jìn)行測定分析。結(jié)果如圖6,且8、9、10月采摘的辣木葉總黃酮提取率呈上升趨勢,10月提取率最大。

    圖6 不同月份辣木葉總黃酮提取率Fig 6 different months Moringa leaf flavonoids extraction rate

    3 討論與結(jié)論

    3.1 提取工藝優(yōu)化 該研究利用浸漬法提取辣木葉總黃酮,同時(shí)采用響應(yīng)面法對辣木葉總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,最后利用方差分析得出了各個(gè)因素對辣木葉總黃酮提取率的影響主次為:濃度(B)>時(shí)間(D)>溫度(A)>料液比(C),同時(shí)表明乙醇濃度和提取時(shí)間對總黃酮的得率影響存在顯著的交互作用。吉莉莉[14]采用微波萃取法考察微波功率、液料比、乙醇濃度和提取時(shí)間等因素對辣木葉總黃酮提取率的影響情況,得到了各因素對總黃酮得率的影響大小排序:微波功率>醇濃度>提取時(shí)間>液料比,其中乙醇濃度和提取時(shí)間對辣木葉總黃酮提取率的影響也較大。陳瑞嬌等[18]采用乙醇提取的方法對辣木葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究,得出了辣木葉總黃酮的最佳提取工藝條件:提取 3 次、每次 1 h、乙醇溶液70%、提取溫度 60 ℃、料液比 1∶20,在此條件下辣木葉的提取液的總黃酮含量可達(dá) 3.95 %。與陳瑞嬌的試驗(yàn)結(jié)果相比,該試驗(yàn)采用的浸漬法縮短了提取時(shí)間,減少了工作量,節(jié)約了材料。對于提取率,該試驗(yàn)的提取率有所降低,可能的原因是試驗(yàn)中使用的辣木葉的產(chǎn)地不同。

    初雅潔[19]對云南不同產(chǎn)地的辣木葉成分進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)辣木葉中均含有黃酮和多酚類活性物質(zhì),且含量差異明顯,說明辣木葉總黃酮的含量與產(chǎn)地有關(guān)。該試驗(yàn)所用的辣木葉均采自四川省通江,由此表明通江地區(qū)種植的辣木的葉子中,總黃酮含量低于其它部分地區(qū)種植的辣木的葉中總黃酮含量。

    通過試驗(yàn)驗(yàn)證,得出在料液比1∶30 (g/mL)、提取時(shí)間30 min、提取溫度55 ℃ 、乙醇濃度75%條件下,辣木葉總黃酮提取率的實(shí)測值為3.018%,且響應(yīng)面的模型與實(shí)際的驗(yàn)證結(jié)果之間擬合情況良好,可為更好地開發(fā)并利用辣木葉總黃酮提供了參考依據(jù)。

    3.2 不同月份辣木葉總黃酮含量分析 利用最佳提取工藝,分別提取8、9、10月在四川省通江地區(qū)采摘的辣木葉中的總黃酮。得到10月采摘的辣木葉總黃酮提取率最高,因通江種植的辣木的葉在8、9、10月生長最為旺盛,且測定結(jié)果表明10月的辣木葉總黃酮提取率最大,說明在10月采摘辣木葉較為合理。為辣木的種植地區(qū)和辣木葉的采摘時(shí)間提供了一定的參考依據(jù),可以有效提高四川省通江地區(qū)辣木產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,推動(dòng)辣木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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