正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選七味地藿顆粒多糖的提取工藝研究

楊耀森，褚秀玲

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城，252059)

研究表明，中藥有效成分多糖類作為新的具有生理活性的天然產(chǎn)物，正受到越來越多科研工作者的高度關(guān)注[1]。到目前為止，已有300多種多糖類化合物從天然藥物中分離出來，其中從植物，尤其是從中草藥中提取的水溶性多糖所占比例最大[2]。因此，試驗(yàn)研究針對(duì)七味地藿顆粒中的多糖提取工藝進(jìn)行深入優(yōu)化研究，其目的在于尋找最佳的提取工藝條件，最大限度地提取組方中的有效成分，充分地發(fā)揮其藥效[3-4]。

試驗(yàn)運(yùn)用的七味地藿顆粒是由熟地黃、淫羊藿、菟絲子等7味中藥據(jù)“君、臣、佐、使”配伍原則配伍而成，七味地藿顆粒具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、助陽益精、祛風(fēng)濕等功效，試驗(yàn)證實(shí)[5]，是一個(gè)療效確切的中藥組方。該組方中主要的有效成份為多糖、黃酮等。因此，試驗(yàn)以方劑多糖為提取對(duì)象，采用水浴提取法[6]，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，研究七味地藿顆粒多糖的最佳提取工藝，為臨床生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)[7-9]。

1 材 料

1.1 試劑 熟地黃、淫羊藿、菟絲子、黃芪、知母、肉桂、陽起石均購自聊城利民大藥店。葡萄糖、濃硫酸和苯酚均購自萊陽經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠。

1.2 儀器設(shè)備 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市雙捷試驗(yàn)儀器廠)；722可見分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)；中藥萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法與設(shè)計(jì)

2.1 多糖含量分析方法的建立 采用苯酚-硫酸顯色體系分光光度法測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取2 g分析純葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，加重蒸水溶解，定容至刻度線，搖勻得20 mg/mL葡萄糖溶液,備用。

苯酚溶液制備：精確稱取5 g苯酚，置于100 mL容量瓶中，加重蒸水使其溶解，定容至刻度線，得到50 mg/mL的苯酚溶液，避光保存，備用。

準(zhǔn)確移取400、500、600、700、800、900、1000 μL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于100 mL容量瓶中，并加入重蒸水定容至刻度線，制成80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的葡萄糖溶液。再分別取1 mL該溶液置于干燥試管中，依次加1 mL苯酚溶液，并迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，冷水浴20 min，于紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定吸光值，重蒸水作空白對(duì)照。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究各因素對(duì)七味地藿顆粒中有效成分多糖提取率的影響。然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。

2.2.1 料液比對(duì)方劑多糖提取率的影響 精確稱量方劑中這7味中藥，共5 份，每份6 g，分別放置錐形瓶中，編號(hào)方便記錄數(shù)據(jù)。然后按照料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例分別將蒸餾水加入至每個(gè)錐形瓶中，80 ℃水浴提取2 h。將剪裁好的500目過濾紗布放入布氏漏斗內(nèi)并將提取物倒入布氏漏斗通過抽氣泵進(jìn)行負(fù)壓抽濾，從而分離到純凈的濾液和藥渣。保存濾液并將藥渣進(jìn)行第二次提取，2 h后過濾。合并濾液，并將濾液用蒸餾水定容至500 mL容量瓶，充分定容混勻后分別量取1 mL，待測(cè)，考察料液比對(duì)方劑多糖提取率的影響。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)方劑多糖提取率的影響 精確稱量準(zhǔn)備試驗(yàn)方劑5 份，每份6 g，分別放置于5個(gè)錐形瓶中并加入150 mL蒸餾水，提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，80 ℃水浴提取，提取一次后過濾按照不同提取時(shí)間提取第二次，其余同2.2.1?？疾焯崛r(shí)間對(duì)方劑多糖提取率的影響。

2.2.3 提取溫度對(duì)方劑多糖提取率的影響 精確稱量準(zhǔn)備試驗(yàn)方劑5份，每份6 g，分別放置于5個(gè)錐形瓶中并加入150 mL蒸餾水，提取溫度分別為60、70、80、90、100 ℃，按照不同提取溫度分別水浴提取2 h，提取一次后過濾相同條件下進(jìn)行二次提取，其余同2.2.1?？疾焯崛囟葘?duì)方劑多糖提取率的影響。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)方劑多糖提取率的影響 精確稱量準(zhǔn)備試驗(yàn)方劑3 份，每份6 g，分別放置于3個(gè)錐形瓶中并加入150 mL蒸餾水，提取次數(shù)按照1、2、3次，80 ℃水浴提取2 h，其余同2.2.1?？疾觳煌崛〈螖?shù)對(duì)方劑多糖提取率的影響。

903 Feasibility of deep learning image-based segmentation algorithm in pathological section of gastric cancer

2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合實(shí)際，在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，制定因素水平表，七味地藿顆粒多糖提取工藝的影響因素有提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)，為此選擇此4因素作為考察因素，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際需要，每因素又選取3個(gè)水平，按照表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，以多糖得率作為衡量多糖提取效率的雙重客觀指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝，為了提高統(tǒng)計(jì)分析的可靠性，每一條件下均進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)(n=3)，測(cè)定結(jié)果取其平均值供統(tǒng)計(jì)分析用。正交試驗(yàn)因素與水平安排見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab 1 Orthogonal test design table

3 結(jié)果與分析

3.1 分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。以葡萄糖的質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，吸光度y(OD值)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖的線性回歸方程為y=0.0064x+0.4037，R2=0.9992，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為80～200 μg/mL范圍時(shí)，線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Glucose standard curve

3.2 單因素對(duì)七味地藿顆粒多糖提取率的影響

3.2.1 料液比對(duì)方劑多糖提取率的影響 由圖2可知，方劑中多糖提取率隨料液比的增大而增大，即加水量越多，多糖的得率越大，多糖的提取率先呈快速上升，后上升平緩，料液比1∶25時(shí)方劑多糖提取率達(dá)到最大，往后隨著料液比的增加而緩慢減少。因此最佳料液比選擇1∶25。

圖2 料液比對(duì)方劑多糖提取率的影響Fig 2 The effect of material liquid on the extraction rate of polysaccharide from the other agent

3.2.2 提取時(shí)間對(duì)方劑多糖提取率的影響 由圖3可知，方劑中多糖提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，即提取時(shí)間越長(zhǎng)，多糖的得率越大，多糖的提取率先呈快速上升，提取時(shí)間為2 h時(shí)方劑多糖提取率達(dá)到最大，往后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢減少。因此，最佳提取時(shí)間選擇2 h。

3.2.3 提取溫度對(duì)方劑多糖提取率的影響 由圖4 可知，方劑中多糖提取率隨提取溫度的提高而增大，即提取溫度越高，多糖的得率越大，多糖的提取率先呈快速上升，提取溫度為90 ℃時(shí)方劑多糖提取率達(dá)到最大，往后隨著提取溫度的提高而緩慢減少。因此，最佳提取時(shí)間為90 ℃。

圖3 提取時(shí)間對(duì)方劑多糖提取率的影響Fig 3 The effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

圖4 提取溫度對(duì)方劑多糖提取率的影響Fig 4 The effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

3.2.4 提取次數(shù)對(duì)方劑多糖提取率的影響 由圖5可知，方劑中多糖提取率隨提取次數(shù)的增多而增大，即提取次數(shù)越多，多糖的得率越大。提取1～2次時(shí)，有效成分濃度差大，提取率上升快；提取次數(shù)為3次時(shí)，與第2次提取相比濃度差小，提取率幾乎并沒提高趨于穩(wěn)定。因此，最佳提取次數(shù)為3次。

圖5 提取次數(shù)對(duì)方劑多糖提取率的影響Fig 5 The effect of extraction times on extraction rate of polysaccharide

3.3 七味地藿顆粒多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果 七味地藿顆粒多糖提取工藝優(yōu)化4因素3水平正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab 2 Results and analysis of orthogonal test

由表2可知，在4個(gè)主要因素中，由極差可以看出D>C>A>B，即提取次數(shù)的影響最大，提取溫度次之，料液比第三，而提取時(shí)間的影響最小。

七味地藿顆粒多糖提取工藝優(yōu)化4因素3水平正交試驗(yàn)結(jié)果方差與顯著性分析見表3。

表3 方差與顯著性分析Tab 3 Analysis of variance and significance

a.R2=0.994(調(diào)整R2=0.997);A料液比 B(誤差)提取時(shí)間 C提取溫度 D提取次數(shù)

由表2可知，提取時(shí)間對(duì)于多糖提取率的影響最小，故將B提取時(shí)間做為誤差項(xiàng)，并對(duì)其他因素進(jìn)行顯著性分析，可得出P值D<0.05

4 討論與結(jié)論

多糖是存在于生物體內(nèi)的一類生物大分子物質(zhì)，具有重要的生物活性[10-11]。多糖的傳統(tǒng)提取方法為水浴煎煮、水提醇沉等方法。因此，試驗(yàn)采取水浴提取多糖，溶劑來源為蒸餾水，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且提取率高[12-13]。

研究表明，方劑多糖提取工藝的最優(yōu)條件為：1∶25為最佳料液比，2 h為最佳提取時(shí)間，90 ℃為最佳提取溫度，最佳提取次數(shù)為3次。另外，經(jīng)正交試驗(yàn)結(jié)果方差與顯著性分析發(fā)現(xiàn)，在影響方劑多糖提取率的主要因素中，以提取次數(shù)的影響最大，且相對(duì)于其他因素顯著(P<0.05)，提取溫度次之，料液比第三，而提取時(shí)間的影響最小，并通過正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝為料液比為1∶25，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為90 ℃，提取次數(shù)為3次。

對(duì)于七味地藿顆粒中有效成分多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，是從單味藥有效成分的提取到組方有效成分的提取的進(jìn)步，從而為臨床應(yīng)用中藥方劑提供試驗(yàn)依據(jù)[14-15]。