阿司匹林丁香酚酯在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)研究

周 豪，楊亞軍，孔曉軍，劉希望，楊孝樸,李劍勇*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

阿司匹林(Aspirin)作為三大經(jīng)典藥物之一，多年來都被作為“解熱鎮(zhèn)痛藥”的代名詞廣泛應(yīng)用于各種原因引起的發(fā)熱、疼痛等病癥。阿司匹林的抗炎作用也是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等病癥的首選藥物之一[1]。20世紀(jì)70年代低劑量的阿司匹林具有抗血小板凝血作用的發(fā)現(xiàn)，使其在心血管疾病的預(yù)防和治療方面有廣泛的應(yīng)用。但阿司匹林長期服用的副作用同樣不容忽視，其對胃腸的刺激性易引起胃潰瘍和胃出血[2]。阿司匹林丁香酚酯(Aspirin Eugenol Ester, AEE)是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所以阿司匹林和丁香酚為原料，經(jīng)過酯化反應(yīng)合成的一種新型非甾體抗炎藥物，該藥物降低了阿司匹林對胃腸道的刺激性，同時增強了揮發(fā)油丁香酚的穩(wěn)定性。截至目前，先后就AEE的藥效學(xué)[3]、急性毒性、慢性毒性、生殖毒性[4-5]、穩(wěn)定性和致畸性[6]等進(jìn)行了研究，顯示AEE具有良好的成藥性。作為一種新的合成藥物，研究AEE的代謝動力學(xué)，以期為全面評價AEE的藥學(xué)性質(zhì)提供依據(jù)，并為臨床合理用藥提供參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑 AEE(純度大于99%)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室制備；阿司匹林(ASA)對照品(批號100113-201405)純度99.8%；水楊酸(SA)對照品(批號100106-201104)純度99.9%；丁香酚(Eugenol)對照品(批號110725-201615)純度99.3%，內(nèi)標(biāo)香草酸(批號110776-201503)純度99.8%，均購于中國食品藥品檢定研究院。內(nèi)標(biāo)4-甲基水楊酸酸甲酯(批號M1584)購于TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。質(zhì)譜級乙腈、甲酸均購于美國新澤西Fisher化學(xué)藥品有限公司；超純水購于廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其他試劑均為分析純及以上。

1.2 儀器設(shè)備 1200高效液相色譜儀，6410B三重四級桿質(zhì)譜儀均為安捷倫公司產(chǎn)品。樣品快速蒸發(fā)儀(美國LABCONCO公司)；高速離心機(Thermo ScientificTMSorvallTMST40)，渦旋混合器(Scientific Industries Vortex Genie2)，超低溫冰箱(海爾DW-86L388A)。

1.3 試驗動物 60日齡成年SD大鼠12只(批號SCXK(G)字2015-001，購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，中國蘭州)，雌雄各半，體重300 g左右。給藥前12 h禁食，自由飲水。

2 方 法

2.1 色譜條件 液質(zhì)聯(lián)用是藥物代謝中最常用的方法[7-9]，根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11]方法并改進(jìn)，確定為：色譜柱為安捷倫ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18(3.0×100 mm,1.8 μm)；流動相A為乙腈，B為水相，水相含有0.1%甲酸和1%的乙腈，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫30 ℃。其中ASA和SA在負(fù)離子模式下同時測定，流動相為等度洗脫(A∶B=3∶7)；AEE和丁香酚在正離子模式下同時測定，流動相為梯度洗脫；水相比例為：0～1 min，50%；1～3 min，35%；3～5 min，20%；5～7 min，50%。

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓正模式下4000 V，負(fù)模式下3500 V。AEE及其待測物的質(zhì)譜條件見表1。

2.3 給藥方案和血樣采集 采用大鼠頸靜脈插管方式采血，手術(shù)后適應(yīng)3 d開始給藥；AEE用0.5%羧甲基纖維素鈉混勻制成濃度為4 mg/mL，按20 mg/kg灌胃給藥[10]。給藥后分別于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h采取血漿樣品；每次采血300 μL左右，采血后補充等量生理鹽水。采取血液樣品置于含肝素鈉的離心管中，4000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃保存。

表1 AEE及其代謝物的質(zhì)譜條件Tab 1 Mass spectrometry detection conditions of AEE and its metabolites

內(nèi)標(biāo): IS1為香草酸；IS2為4-甲基水楊酸甲酯

Internal standard: IS1 is vanillic acid, IS2 is methyl 4-methyl salicylate

2.4 樣品處理 將待測血漿樣品置于室溫，待其完全融化，用移液器精密移取50 μL置于離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)和300 μL乙腈，渦旋震蕩30 s,4 ℃條件下14000 g離心10 min，取上清液用樣品快速蒸發(fā)儀除去溶劑，加入200 μL流動相復(fù)溶，渦旋震蕩30 s,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取AEE和丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品,以乙腈為溶劑配制成濃度為 5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，加入空白血漿50 μL和1 μg/mL內(nèi)標(biāo)(4-甲基水楊酸甲酯)10 μL，按2.4項方法操作，進(jìn)樣10 μL，以待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)對相應(yīng)的待測物濃度(X)作線性回歸，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

精密稱取阿司匹林和水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈為溶劑配制成濃度為5、10、50、100、500、1000、5000、10000 ng/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液。內(nèi)標(biāo)(香草酸)為1 μg/mL；同上操作，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)處理 藥物濃度-時間數(shù)據(jù)采用WinNonLin5.2軟件擬合藥物動力學(xué)模型,計算出藥代動力學(xué)參數(shù)。

3 試驗結(jié)果

3.1 專屬性考察 在選定的色譜條件下，AEE和代謝物丁香酚以及ASA和SA可以實現(xiàn)很好的分離，見色譜圖1。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 ASA的血藥濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.00749X+0.08341，R2=0.9927，SA為Y=0.0143X+0.08335，R2=0.9996，線性范圍均為5～10000 ng/mL。AEE的血藥濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.0183X+1.1750，R2=0.9973，丁香酚為：Y=0.0119X+0.03617，R2=0.9959，線性范圍均為5～1000 ng/mL。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度 取血漿樣品按高、中、低3個濃度，每個濃度5個平行樣品。按2.4樣品處理方法項處理后進(jìn)樣分析，以一天內(nèi)5次測定結(jié)果計算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；連續(xù)測定3 d計算日間精密度和準(zhǔn)確度。本方法測定的AEE及其代謝物的血漿樣品的日內(nèi)和日間精密度均RSD<10%，結(jié)果符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定。血漿樣品測定AEE及其代謝物日內(nèi)精密度、日間精密度和準(zhǔn)確度以及回收率見表2。

3.4 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿樣品按2.4項方法處理后，加入高、中、低3種不同濃度的待測物，每個濃度設(shè)3個平行樣品；測得樣品中被測物的峰面積，與用流動相配制的相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測物的峰面積比較，計算基質(zhì)效應(yīng)。4種待測物及內(nèi)標(biāo)在高、中、低3個濃度血漿樣品中基質(zhì)效應(yīng)均在85%～115%之間，說明血漿樣品處理方法中對被測成分影響不大，方法穩(wěn)定可靠。

3.5 穩(wěn)定性 對樣品的穩(wěn)定性考察主要有短期穩(wěn)定性的考察:短期穩(wěn)定性樣品配好后，在室溫條件下放置6 h后分析；凍融穩(wěn)定性考察：樣品反復(fù)凍融(-80 ℃)3次后，進(jìn)樣分析；長期穩(wěn)定性考察:將樣品在-80 ℃條件下存放三周后分析。樣品穩(wěn)定性結(jié)果見表3，樣品穩(wěn)定性RSD值均小于15%，表明血漿中被測物濃度可以被準(zhǔn)確測定。

A. 空白血漿；B. 空白血漿加入EUG(丁香酚)、IS2(4-甲基水楊酸甲酯)和AEE標(biāo)準(zhǔn)品；C. 給藥1 h后血漿中加入內(nèi)標(biāo)IS2;D. 空白血漿加入內(nèi)標(biāo)IS1(香草酸)、ASA和SA標(biāo)準(zhǔn)品；E. 給藥1 h后血漿中入內(nèi)標(biāo)IS1A.Representative chromatograms of blank plasma samples; B.Representative chromatograms of EUG, IS2, and AEE in blank Plasma samples spiked with analytes; C.One hour after administration, the representative chromatograms of IS2 was add to the Plasma samples; D.Representative chromatograms of IS1, ASA and SA in blank Plasma samples spiked with analytes; E.One hour after administration, the representative chromatograms of IS1 was add to the Plasma samples.圖1 色譜圖Fig 1 Representative Chromatogram

待測物Compoundname濃度/(ng·mL-1)concentration日內(nèi)(intra-day)日間(inter-day)精密度RSD/%Precision準(zhǔn)確度(RE)accuracy精密度RSD/%Precision準(zhǔn)確度(RE)accuracy回收率/%recoveryASA208.883.579.628.5681.42±6.175004.35-1.253.221.1884.33±3.2850003.00-0.255.182.3285.26±4.37SA203.501.135.464.5494.79±5.175001.02-0.734.782.5497.28±3.5150002.561.155.971.2798.63±3.48AEE203.853.667.852.5979.82±5.341006.542.376.013.2280.23±3.145001.360.233.910.7784.19±5.15EUG207.133.327.672.2276.38±4.221008.161.336.861.3979.46±5.835002.04-0.192.630.3484.30±4.41

表3 AEE及其代謝物樣品穩(wěn)定性考察Tab 3 Stability of AEE and its metabolites

3.6 大鼠口服給藥后體內(nèi)藥動學(xué)分析 大鼠灌胃給藥后，按時間點采集血樣，經(jīng)處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析。根據(jù)不同時間點的數(shù)據(jù)，對AEE及其代謝物在大鼠血漿內(nèi)隨時間的濃度變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：AEE和阿司匹林在血漿中無法檢出，丁香酚在血漿中能被檢出，但在0～48 h內(nèi)均未達(dá)到定量限。水楊酸在大鼠血漿中隨時間的濃度變化的藥-時曲線見圖2，并計算了水楊酸的主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。

圖2 AEE給藥后大鼠體內(nèi)水楊酸的平均血藥濃度-時間曲線(mean±SD, n=12)Fig 2 The mean plasma concentration of SA versus time after AEE administration in rat (mean±SD, n=12)

參數(shù)mean±SDAUC/(h·ng·mL-1)51046.37±15570.51K01_HL/h2.10±1.07K10_HL/h6.56±3.52CL_F/(mL·h-1)432.01±148.41Tmax/h4.35±1.09Cmax/(ng·mL-1)3356.90±1120.37

4 討 論

目前對于AEE臨床藥理方面的研究顯示其具有良好的成藥性；該藥物降低了阿司匹林對胃腸道刺激性的同時，增強了丁香酚的穩(wěn)定性；但對于其在嚙齒類動物體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)的研究是空白的。對AEE在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)研究有利于解釋其藥理作用機理及作用過程，對于指導(dǎo)新藥設(shè)計，提高新藥療效和安全性，科學(xué)的制定藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。

本試驗所建立的LC-MS/MS方法能夠分別同時檢測血漿中AEE及代謝產(chǎn)物丁香酚、阿司匹林和水楊酸。色譜條件在文獻(xiàn)[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，由單一代謝物的逐個測定改為同一模式下多個代謝物同時測定。AEE和丁香酚同時測定的流動相采用梯度洗脫，節(jié)省了樣品測定時間。在文獻(xiàn)[11]的基礎(chǔ)上對阿司匹林的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，增強了阿司匹林響應(yīng)值的同時減輕了源內(nèi)裂解的現(xiàn)象。方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法具有專屬性好、準(zhǔn)確度高、精密度好和靈敏度高等特點，與文獻(xiàn)[10]相比更適用于AEE及其代謝產(chǎn)物在動物體內(nèi)的血藥濃度的測定和藥代動力學(xué)研究。

AEE以20 mg/kg單劑量口服給藥后，測定血漿中AEE及其代謝物丁香酚、阿司匹林和水楊酸的濃度，以研究AEE及其活性代謝產(chǎn)物在體內(nèi)情況。一方面明確可能的藥理活性物質(zhì)如AEE和阿司匹林、丁香酚的存在與否，另一方面研究已知的活性代謝產(chǎn)物水楊酸的濃度及動力學(xué)[10]。AEE經(jīng)口服給藥后，AEE及其代謝物阿司匹林在血漿中幾乎檢測不到；丁香酚在血漿中能被檢出，但在0～48 h內(nèi)均達(dá)不到定量限；水楊酸在血漿中的濃度較高。該實驗證實了口服給藥后AEE在體內(nèi)迅速代謝，其血漿濃度較低，主要由水楊酸和丁香酚在體內(nèi)發(fā)揮其藥理活性。

據(jù)文獻(xiàn)報道[12]，阿司匹林以10 mg/kg單劑量灌胃給藥后在SD大鼠體內(nèi)水楊酸的達(dá)峰時間(Tmax)為2.17±0.98 h，達(dá)峰濃度(Cmax)為1.904±0.208 μg/mL，半衰期為5.208±1.699 h；藥時曲線面積(AUC)為16.720±3.086 h·μg·mL-1。通過AEE代謝物水楊酸的藥物動力學(xué)參數(shù)對比可以看出：在幾乎相同的克分子數(shù)下，AEE比阿司匹林代謝的水楊酸藥效作用更強，在較長時間內(nèi)能保持較高的血藥濃度，因此，僅就代謝物而言，AEE能更好地發(fā)揮阿司匹林的藥效作用，給藥間隔可以是阿司匹林的2～3倍，給藥間隔以1 d 1次足以達(dá)到治療效果。