沉默F(xiàn)STL1減少衣霉素誘導(dǎo)軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細胞凋亡

楊 蓉，王美美*，楊 楊，許 晉，徐曉龑，施 青，劉璘琛

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 江蘇 南京 210009；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科， 江蘇 南京 210009)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)作為常見的關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變及繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要表現(xiàn)，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷，甚至累及整個關(guān)節(jié)，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1]。OA發(fā)生機制較為復(fù)雜，目前尚未完全清楚。軟骨細胞作為成熟關(guān)節(jié)軟骨中維持正常生理功能最為重要的細胞，其異常凋亡在OA發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在調(diào)控軟骨細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[3]。衣霉素處理軟骨細胞是構(gòu)建OA發(fā)病細胞模型的重要方法[4]，主要通過ERS而介導(dǎo)軟骨細胞凋亡。卵泡抑素樣蛋白1(follistatin-like protein 1，F(xiàn)STL1)作為分泌性胞外糖蛋白，廣泛存在于人體組織，在細胞增殖、分化、凋亡、免疫及炎性反應(yīng)等多種生理功能中發(fā)揮重要作用[5]。本研究擬利用小分子RNA干擾技術(shù)特異性沉默F(xiàn)STL1基因，觀察其對衣霉素誘導(dǎo)軟骨細胞ERS及細胞凋亡的影響，以及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：衣霉素(Sigma-Aldrich公司)，用無水乙醇制備衣霉素溶液，實驗前用含0.5% FBS培養(yǎng)液配制濃度2 μg/mL；DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(TaKaRa公司)；siRNA-FSTL1和siRNA-NC序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計、合成和鑒定)；FSTL1、Bcl- 2、Bax及內(nèi)參基因引物(上海生工生物公司設(shè)計合成)；MTT法細胞增殖檢測試劑盒(上海哈靈生物試劑檢測中心)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)；兔抗大鼠蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)多克隆抗體、兔抗人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)多克隆抗體、兔抗鼠活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)多克隆抗體和兔抗大鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)多克隆抗體(Santa Cruz公司)；兔抗大鼠鈣網(wǎng)蛋白(Cal)多克隆抗體(Abcam公司)；兔抗大鼠p-PERK、eIF2α和p-eIF2α多克隆抗體(CST公司)。

1.1.2 動物：普通級新西蘭兔，雄性，6周齡，體質(zhì)量1.2～1.3 kg[南京金陵種兔場，生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2012- 0003]。

1.2 方法

1.2.1 兔軟骨細胞分離、培養(yǎng)及分組處理：取兔膝關(guān)節(jié)軟骨，切成1 mm3大小組織塊，0.25%胰蛋白酶消化60 min，用0.20% Ⅱ型膠原酶消化4～6 h，離心后，獲得軟骨細胞。將細胞置于含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，制備細胞懸液，調(diào)整細胞為2×105個/mL，接種于培養(yǎng)板中，待細胞匯合度達85%～90%時，將細胞分為：1)空白對照組：不加入任何處理；2)衣霉素組：加入2 μg/mL衣霉素溶液；3)衣霉素+siRNA-FSTL1組：加入2 μg/mL衣霉素溶液同時，利用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染siRNA-FSTL1序列：5′-UGCAAAUACUUACGGACU UUU-3′；4)衣霉素+siRNA-NC組：加入2 μg/mL衣霉素溶液同時，用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染siRNA-NC序列5′-GCAUCUUGAGAUUUAAUCA-3′。培養(yǎng)48 h后對各處理組進行相關(guān)實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖：取各處理組細胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞為2×103個/孔，接種于96孔板，待細胞貼壁后，分別于24、48、72和96 h時，加入20 μL MMT(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，將DMSO 150 μL加入各孔，振蕩15 min，待結(jié)晶物溶解完全。全自動酶標(biāo)儀取490 nm波長處對各孔吸光度(A)值進行檢測。

1.2.3 流式細胞計量術(shù)檢測細胞凋亡：取各處理組培養(yǎng)48 h后細胞，胰蛋白酶消化后，離心留取細胞沉淀，重懸后，調(diào)整細胞為1×106個/mL，接種于6孔板，過夜后無血清處理12 h，向各組分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，24 h后收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌3次，將預(yù)冷乙醇4 ℃下固定5 h，離心留取細胞沉淀，PBS洗滌3次，用結(jié)合緩沖液500 μL重懸細胞，將Annexin V-FITC 5 μL加入后，再加入PI 5 μL，避光反應(yīng)20 min，于60 min內(nèi)利用流式細胞儀對樣品進行檢測。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測細胞中FSTL1、Bcl- 2和BaxmRNA含量：取各處理組培養(yǎng)48 h后細胞，加入細胞裂解液進行裂解后，用Trizol總RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA的純度，取A260/A280≥2.80樣品完成后續(xù)實驗。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。FSTL1引物：上游為5′-CCTGTG TGTGGCAGTAATGG-3′，下游為5′-TCAGGAGGGTT GAAAGATGG-3′；Bcl- 2引物：上游為5′-CACAAGA GGCCAAGGCTACCT-3′，下游為5′-CAGGAAAGCAG GAAGTCTCAA-3′；Bax引物：上游為5′-ATTGAGA AACGATTTGCCTACA-3′，下游為5′-GGGAAATGG CTTATTCTCCTTTGCTT-3′；β-actin引物：上游為5′-CCTCATGAAGATCCTGACCG-3′，下游為5′-ACCG CTCATTGCCGATAGTG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s，連續(xù)進行38個循環(huán)，每個樣品均設(shè)置6個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法對各處理組細胞中FSTL1、Bcl- 2及Bax基因相對表達量進行分析。

1.2.5 Western blot檢測各處理組細胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表達：取各處理組培養(yǎng)48 h后細胞，加入細胞裂解液進行裂解，利用總蛋白提取試劑盒對總蛋白進行提取，用BCA蛋白檢測試劑盒對總蛋白純度進行檢測。取25 μg總蛋白，進行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，分別將加入一抗兔抗大鼠PERK、CHOP、Cal、p-PERK、eIF2α或p-eIF2α多克隆抗體、兔抗人GRP78多克隆抗體、兔抗鼠ATF4多克隆抗體(稀釋比例分別為：1∶500、1∶1 200、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶800、1∶200、1∶2 000)，4 ℃下過夜孵育，用TBST洗膜3次，將二抗加入，孵育90 min，用化學(xué)發(fā)光試劑盒避光反應(yīng)30 min，拍照，利用Image J圖像分析軟件對PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白相對表達量進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各處理組細胞增殖情況比較

與對照組相比，衣霉素組、衣霉素+siRNA-NC組和衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞增殖能力被明顯抑制(P<0.05)，與衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組相比，衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞增殖能力顯著提高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with tunicamycin group; △P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group圖1 MTT法檢測各處理組細胞的增殖Fig 1 Cell proliferation in each treatment group was detected by using MTT assay

2.2 各處理組細胞凋亡情況比較

對照組、衣霉素組、衣霉素+siRNA-NC組和衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞凋亡率分別為6.3%±2.8%、27.4%±4.6%、25.5%±3.9%和15.2%±3.7%(P<0.001)；兩兩比較，與對照組相比，衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組細胞凋亡率均升高，與衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組相比，衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞凋亡率降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 各處理組細胞中FSTL1、Bcl- 2和Bax基因表達的比較

與空白對照組相比，衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組細胞中FSTL1和BaxmRNA相對表達量均升高，而Bcl- 2 mRNA相對表達量均降低(P<0.05)；與衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組相比，衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞中FSTL1和BaxmRNA相對表達量均降低，而Bcl- 2 mRNA相對表達量均升高(P<0.05)(表1)。

A.control group；B.tunicamycin group；C.tunicamycin+siRNA-NC group；D.tunicamycin+siRNA-FSTL1 group圖2 流式細胞計量術(shù)檢測各處理組細胞凋亡情況Fig 2 Cell apoptosis in each treatment group was detected by using flow cytometry

groupFSTL1 mRNABcl-2 mRNABax mRNAcontrol group1.17±0.111.73±0.121.22±0.07tunicamycin group1.95±0.16*1.24±0.08*1.86±0.13*tunicamycin+siRNA-NC group1.97±0.18*1.25±0.07*1.89±0.15*tunicamycin+siRNA-FSTL1 group1.56±0.13*#△1.43±0.10*#△1.51±0.11*#△

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with tunicamycin group;△P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group.

2.4 各處理組細胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表達比較

與空白對照組相比，衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組細胞中PERK、eIF2α蛋白相對表達量均降低，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相對表達量均升高(P<0.05)，與衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組相比，衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞中PERK和eIF2α蛋白相對表達量均升高，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相對表達量均降低(P<0.05)(表2，圖3)。

3 討論

軟骨細胞作為成熟軟骨中唯一存在的細胞類型，在維持關(guān)節(jié)軟骨正常功能及損傷修復(fù)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，然而，由于關(guān)節(jié)軟骨中缺少血管及神經(jīng)，軟骨細胞只能靠滲透作用而維持正常代謝，因而對各種刺激較為敏感，易發(fā)生損傷及凋亡[6]。ERS作為早期細胞抵御外界有害刺激的適應(yīng)性反應(yīng)， 一旦持續(xù)則可導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生[7]。衣霉素作為天然核苷抗生素，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂及未折疊蛋白蓄積而導(dǎo)致ERS[8]。本研究顯示，衣霉素組軟骨細胞增殖被抑制，而細胞凋亡率增加、凋亡相關(guān)基因表達異常，說明衣霉素可促進軟骨細胞凋亡發(fā)生。

表2 各處理組細胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表達比較

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with tunicamycin group;△P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group.

圖3 Western blot檢測各處理組細胞中蛋白表達Fig 3 Expressions of proteins in each treated group were detected by using Western blot

PERK作為存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種膜蛋白，是介導(dǎo)ERS過程的重要信號通路[9]。細胞發(fā)生ERS時，PERK與GRP78解離，被磷酸化而激活，通過促使下游的eIF2α磷酸化而減少蛋白合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，但當(dāng)應(yīng)激較嚴(yán)重或持續(xù)時間較長時，磷酸化的PERK則通過eIF2α促使ATF4大量表達，而ATF4又可促使CHOP大量表達而促使細胞凋亡[10]。本研究顯示，與對照組相比，衣霉素組細胞中PERK、eIF2α蛋白相對表達量均降低，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白表達量均升高，說明衣霉素通過使軟骨細胞內(nèi)鈣超載而激活PERK信號通路，促使ERS發(fā)生及細胞凋亡。

FSTL1作為存在于細胞外的基質(zhì)糖蛋白，參與了炎性反應(yīng)及免疫功能調(diào)節(jié)，與自身免疫性疾病關(guān)系密切[11]。本研究顯示，衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞中FSTL1表達量顯著降低。提示，軟骨細胞中FSTL1被成功抑制。本研究顯示，與衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組相比，衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞增殖顯著提高，細胞凋亡率降低，凋亡促進基因Bax被抑制，而凋亡抑制基因Bcl- 2則表達增加。說明特異性抑制FSTL1表達，可有效抑制衣霉素導(dǎo)致的軟骨細胞細胞凋亡。而相比與衣霉素組和衣霉素+siRNA-NC組，衣霉素+siRNA-FSTL1組細胞中PERK和eIF2α蛋白表達量升高，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白表達量降低，說明特異性抑制細胞中FSTL1表達，可有效抑制PERK信號通路，從而減少ERS發(fā)生。

綜上所述，特異性沉默軟骨細胞中FSTL1表達可有效減少ERS及細胞凋亡，其機制可能與抑制PERK信號通路有關(guān)。