銀膠菊內(nèi)酯減輕氧糖剝奪/再灌注誘導的PC12細胞損傷

張軍峰，徐 曦，徐倉寶，張一博，房智超，郝佳暉，趙朝華*

(西安醫(yī)學院 1.陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室；2.人體解剖學教研室，陜西 西安710021)

腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是一種常見病[1]，近年來其診治取得了一定進展，但其療效仍不理想[2]，因此，更好的揭示腦I/R損傷的分子機制非常重要。許多研究表明氧化應激與腦I/R損傷發(fā)病密切相關，抑制氧化應激或許是治療腦I/R損傷的一種好方法。

銀膠菊內(nèi)酯/小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PTN)是從菊科植物(小白菊)中分離出來的一種藥倍半萜烯內(nèi)酯[3]，在永久性大腦中動脈阻塞模型的研究中發(fā)現(xiàn)，PTN可以明顯減輕神經(jīng)功能損傷、腦水腫及減少腦梗死體積[4]。但是PTN是否能對抗腦I/R損傷尚不清楚。本研究用氧-葡萄糖剝奪-再灌注(oxygen-glucose deprivation-reperfuison, OGD/R)模型觀察PTN對OGD/R誘導的大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞(PC12細胞)凋亡的神經(jīng)保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12細胞(ATCC公司)。

1.1.2 試劑：胎牛血清(Gibco公司)；PTN、鏈霉素、青霉素(Sigma-Aldrich公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；Hank’s平衡鹽溶液(Invitrogen公司)；CCK-8(Dojindo公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)(Promega公司)；二喹啉甲酸(bicinchonininc acid, BCA)、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、過氧化氫酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；capase-3活性檢測試劑盒(Abcam公司)；小鼠抗Bcl-2、Bax、Akt、GSK-3β、p-Akt、p-GSK-3β、GAPDH單克隆抗體和HRP標記的兔抗小鼠二抗(Santa Cruz公司)；ECL試劑盒(Pierce公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理：將細胞分為對照組、OGD/R組和OGD/R+PTN預處理組(1、5、10和20 μmol/L),每組n=3。對照組PC12細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM和F12(DMEM∶F12=1∶1)混合液(完全培養(yǎng)基)進行培養(yǎng)，細胞置于含有95%空氣和5% CO2孵箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)。OGD/R組參照文獻[5]，OGD處理4 h，再正常培養(yǎng)24 h。OGD/R+PTN預處理組：在OGD之前1 h，將PTN加入細胞培養(yǎng)基中，最終工作濃度分別為1、5、10和20 μmol/L。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力：用CCK-8檢測細胞活力，將PC12細胞接種于96孔板中(1.0×104個/孔)，加入不同濃度PTN(1、5和10 μmol/L)后，進行OGD/R處理。OGD/R結束后，每孔加入10 μL CCK-8。37 ℃孵育1 h，用分光光度計在490 nm波段檢測吸光度值。

1.2.3 LDH法檢測細胞毒性：按照操作說明，在各種處理結束后，收集細胞培養(yǎng)上清液，檢測LDH含量。以正常培養(yǎng)的PC12細胞培養(yǎng)基中LDH含量為基準(100%)，用百分比表示各組細胞LDH釋放量。

1.2.4 檢測活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量：按熒光探針DCFH-DA試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)ROS含量。主要步驟如下：將細胞用DCFH-DA以20 μmol/L的終濃度于37 ℃孵育30 min(避光)，PBS洗3次(5 min/次)，用熒光酶標儀檢測熒光強度。

1.2.5 抗氧化酶及caspase-3活性的檢測：各組處理完成后，收集細胞、冰上裂解20 min，收集細胞勻漿，以4 ℃、12 000 r/min，離心15 min，收集上清液。細胞內(nèi)抗氧化酶活性用試劑盒分別檢測過氧化氫酶、SOD和GPx的活性。用caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3活性。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達：RIPA裂解法抽提細胞總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測定的蛋白濃度，將各樣品的蛋白濃度調節(jié)一致；經(jīng)過SDS-PAGE、蛋白轉印后，用含有5%脫脂奶粉的封閉液將轉印好的硝酸纖維素膜，室溫孵育，封閉1 h；加一抗：小鼠抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1 000)、小鼠抗Bax單克隆抗體(1∶1 000)、小鼠抗Akt、GSK-3β單克隆抗體(1∶500)、小鼠抗p-Akt、p-GSK-3β單克隆抗體(1∶500)、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的兔抗小鼠二抗(均為1∶2 000)，37 ℃孵育2 h； ECL成像，全自動凝膠成像系統(tǒng)G：BOX中采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 PTN增加ODG/R處理后PC12細胞活力及減少LDH釋放

與對照組相比，OGD/R處理組PC12細胞活力明顯減小(P<0.01)、培養(yǎng)上清液中LDH量均明顯升高(P<0.05)。1、5、10和20 μmol/L PTN預處理組PC12細胞活力均較OGD/R組明顯回升(P<0.05)、培養(yǎng)上清液中LDH含量均明顯減少(P<0.05)(圖1)。

2.2 PTN降低ODG處理后PC12細胞中ROS水平及增加酶活性

與正常組相比，OGD/R處理可以明顯增加PC12細胞內(nèi)ROS水平(2.8倍)P<0.01)(圖2)。與OGD/R組相比，PTN預處理(1、5和10 μmol/L)組PC12細胞內(nèi)ROS水平又明顯降低(P<0.05)(圖2)，過氧化氫酶(P<0.05)、SOD(P<0.05)和GPx(P<0.05)(圖2)的活性明顯升高。

2.3 PTN對ODG/R后PC12細胞中Bax/Bcl-2-caspase3信號通路的影響

與正常組相比，OGD/R處理組PC12細胞Bax表達量和caspase-3活性明顯升高，Bcl-2表達量明顯降低(P<0.05)(圖3)。而與OGD/R處理組相比，10 μmol/L PTN預處理組PC12細胞內(nèi)Bax表達量和caspase-3活性明顯降低，Bcl-2表達明顯升高(P<0.05)(圖3)。

2.4 PTN促進ODG處理后PC12細胞內(nèi)Akt和GSK-3β的磷酸化

與正常組相比， ODG/R組PC12細胞內(nèi)p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β值明顯減少(P<0.01)(圖4)。而與OGD/R組相比，PTN預處理組PC12細胞內(nèi)p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β值明顯回升(P<0.01)(圖4)。

3 討論

OGD/R是在體外研究缺血的一種常用模型，其可以模擬缺血誘導的細胞損傷[6]。本研究發(fā)現(xiàn)OGD/R處理明顯降低PC12細胞活力，增加LDH釋放，與文獻報道一致[5,7]。而PTN可以明顯促進PC12細胞存活，減少LDH釋放，提示PTN具有對抗OGD/R誘導細胞損傷的作用。在檢測細胞活力實驗中，由于10 μmol/L與20 μmol/L PTN預處理對PC12細胞活力無顯著差異，因此選擇了10 μmol/L作為工作濃度。

*P<0.01 compared with control group; #P<0.05 compared with OGD/R group圖1 PTN預處理對OGD/R后PC12細胞的活力及LDH釋放的影響Fig 1 Pretreatment with PTN increased cell viability and prevented LDH release in OGD-treated PC12 n=3)

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group; #P<0.05 compared with OGD/R group圖2 PTN預處理對OGD/R后PC12細胞內(nèi)ROS及酶活性的影響

A.Western blot; B.caspase-3 activity assay; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with OGD/R group

本研究發(fā)現(xiàn)OGD/R誘導ROS產(chǎn)物，但PTN可以明顯抑制這一過程。PTN還可以明顯修復OGD/R處理后PC12細胞中過氧化氫酶、SOD和GPx的活性。說明PTN可以抑制OGD/R誘導的氧化應激，其可能是通過抑制ROS的聚集、增加酶的活性來實現(xiàn)的[8-9]。

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with OGD/R group圖4 PTN預處理增強OGD/R后PC12細胞內(nèi)Akt和GSK-3β磷酸化Fig 4 PTN promoted the phosphorylation of Akt and GSK-3β in OGD-treated PC12 n=3)

凋亡是引起腦I/R損傷的主要原因[8]。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白 (如Bcl-2和Bcl-xL)和促凋亡蛋白(如Bax和Bak)。Bcl-2/Bax的比值可以很好的反映凋亡的調節(jié)情況[10]。在缺血性腦卒中的動物模型中，caspase-3也是一個非常重要的凋亡調節(jié)因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTN可以明顯下調OGD/R處理后PC12細胞中Bax的表達及caspase-3的活性，而上調Bcl-2的表達量。提示PTN可以通過降低OGD/R介導的caspase-3激活、上調Bcl-2表達，對體外培養(yǎng)的PC12細胞產(chǎn)生保護作用。

在腦I/R損傷的進程中，Akt/GSK-3β信號通路也起著非常重要的作用[12-13]。Akt是PI3K的一個下游激酶，其可以通過磷酸化被激活，進而調控細胞死亡和存活。在腦缺血病理進程中，Akt可以通過磷酸化下游的靶分子GSK-3β，進而調控線粒體信號傳導和細胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)PTN可以明顯促進OGD/R處理后PC12細胞內(nèi)Akt和GSK-3β的磷酸化。提示PTN可能通過激活Akt/ GSK-3β信號通路，對OGD/R誘導的PC12細胞損傷產(chǎn)生保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PTN對OGD/R誘導的損傷具有神經(jīng)保護作用，其可能是通過激活Akt/ GSK-3β信號通路來實現(xiàn)的，PTN可能會成為一種潛在的治療腦I/R損傷的藥物。