SFRP5對小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1- 6糖代謝的影響

朱 偉，鄭世霞，柯琳秋，汪 毅，陳瓊科，夏道涵，王紅漫

(重慶市人民醫(yī)院 內(nèi)分泌/中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400014)

分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(secreted frizzled related protein 5，SFRP5)是存在于成熟脂肪細(xì)胞中的一種細(xì)胞激素，可參與非經(jīng)典的Wnt信號代謝通路[1]。目前對SFRP5的研究主要集中在炎性反應(yīng)與肥胖，而其對肥胖和糖代謝的影響還存在爭議。在多種肥胖動(dòng)物模型中，SFRP5 mRNA和蛋白水平表達(dá)降低，并且給予SFRP5敲除鼠高卡路里飲食會導(dǎo)致其產(chǎn)生嚴(yán)重的葡萄糖耐量受損和肝臟脂肪變性[1]，也有研究指出在肥胖狀態(tài)下，SFRP5的mRNA表達(dá)水平上升[2- 4]；而在臨床研究中也是眾說紛紜，有研究報(bào)道其血清蛋白水平在肥胖和瘦的人類受試者無差異[3]，亦有報(bào)道顯示在肥胖和2型糖尿病人群中，血漿SFRP5水平呈下降趨勢[5]。因此，SFRP5在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用有待探索驗(yàn)證。

為了探討SFRP5在糖代謝和胰島素抵抗中的相關(guān)作用機(jī)制，本研究在細(xì)胞層面對SFRP5進(jìn)行病毒感染，上調(diào)或下調(diào)SFRP5表達(dá)，干預(yù)成功后對細(xì)胞葡萄糖攝取、糖異生途徑和胰島素信號通路水平進(jìn)行研究，旨在為SFRP5在糖代謝中可能的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SFRP5過表達(dá)病毒(Ad-SFRP5)和SFRP5抑制病毒(Ad-shSFRP5)(重慶茂晶科技有限公司)；小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1- 6(本實(shí)驗(yàn)室保存)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；二甲亞砜(DMSO)(Sigma Aldrich公司)；人工合成胰島素(諾和靈)(諾和諾德制藥有限公司)；葡萄糖測定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；RNA抽提試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Syber Green(TaKaRa公司)；細(xì)胞蛋白裂解液RIPA和BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；蛋白marker(Thermo Fisher公司)；β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；鼠抗SFRP5和兔抗PEPCK(Santa Cruz公司)；兔抗G6Pase(Abcam公司)；兔抗p-InsR、兔抗t-InsR、兔抗p-AKT和兔抗t-AKT(CST公司)；山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；化學(xué)發(fā)光試劑ECL(Milipore公司)；SFRP5、PEPCK、G6Pase和β-actin引物均合成于(Invitrogen公司)。引物序列為：SFRP5：上游引物：5′-TCTTCCTCTGCTCGCTC TTC-3′，下游引物：5′-GGGCTCCAATCAACTTTCG-3′；PEPCK：上游引物：5′-GCATAACGGTCTGGACTTCT-3′，下游引物：5′-TGATGACTGTCTTGCTTTCG-3′；G6Pase：上游引物：5′-AATCTCCTCTGGGTGGC-3′，下游引物：5′-GCTGTAGTAGTCGGTGTCC-3′；β-actin：上游引物：5′-CCCATCTACGAGGGCTAT-3′，下游引物：5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：在37℃水浴復(fù)蘇凍存的Hepa1- 6細(xì)胞，按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。將對數(shù)期增殖的細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)，貼壁后分為對照組(Ad-GFP)和實(shí)驗(yàn)組：SFRP5過表達(dá)組(Ad-SFRP5)和SFRP5抑制組(Ad-shSFRP5)。

1.2.2 細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)：將Hepa1- 6細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞匯合到80%左右，用病毒感染細(xì)胞48 h后，用葡萄糖氧化酶法-過氧化物酶法(GOD-POD)測定各組Hepa1- 6細(xì)胞的葡萄糖攝取率。將細(xì)胞用人工合成胰島素(100 nmol/L)刺激6 h，收取每孔上清液并離心，按照葡萄糖試劑盒的操作步驟將R1，R2按照4∶1比例混合成工作液并加入96孔板中，再加入離心后的各樣本培養(yǎng)液上清，用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，波長為550 nm。根據(jù)公式：葡萄糖濃度(Glu)(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)品濃度×(樣本OA值-空白OA值)/(標(biāo)準(zhǔn)品OA值-空白管OA值)計(jì)算葡萄糖濃度。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測細(xì)胞內(nèi)SFRP5、PEPCK、G6Pase基因的mRNA相對表達(dá)水平：6孔板內(nèi)細(xì)胞增殖到約80%，經(jīng)SFRP5過表達(dá)和抑制病毒分別作用2 d后，用1 mL/孔Trizol收取細(xì)胞并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。以每個(gè)樣本的循環(huán)數(shù)與β-actin循環(huán)數(shù)的Ct值的比值作為該樣本mRNA表達(dá)的相對數(shù)值。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)糖異生及胰島素信號通路的變化：6孔板內(nèi)細(xì)胞匯合到80%左右，經(jīng)SFRP5過表達(dá)和抑制病毒分別作用72 h后，用100 mmol/L胰島素處理細(xì)胞10 min，再用細(xì)胞蛋白裂解液RIPA+磷酸酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，接著轉(zhuǎn)膜和封閉后將PVDF膜與配制好的一抗稀釋液(SFRP5稀釋比例1∶100；PEPCK、G6Pase、p-InsR、t-InsR、p-AKT、t-AKT和β-actin均為1∶1 000)至于4 ℃冰箱孵育過夜。次日用TBST洗脫多余的一抗稀釋液3次，每次洗脫10 min，再將PVDF膜與二抗稀釋液(1∶2 000)置于37 ℃孵育1 h后，用TBST洗脫多余抗體稀釋液，步驟同上。隨后加ECL試劑反應(yīng)，在化學(xué)發(fā)光儀上顯影，成像。圖像以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One分析軟件計(jì)算條帶吸光度值對各蛋白進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SFRP5過表達(dá)及抑制病毒的感染效率

Hepa1- 6細(xì)胞經(jīng)Ad-SFRP5病毒或Ad-shSFRP5病毒分別作用2～3 d后與空載病毒對照組(Ad-GFP)相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中SFRP5基因的mRNA水平和蛋白相對水平均相應(yīng)增高或降低(P<0.01)(圖1)。

2.2 葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)

與空載病毒組相比，SFRP5過表達(dá)組培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度明顯降低(P<0.01)，而SFRP5抑制組則呈現(xiàn)葡萄糖攝取障礙(圖2)。

2.3 Hep1- 6細(xì)胞肝糖異生指標(biāo)檢測

與Ad-GFP組相比，Ad-SFRP5組糖異生指標(biāo)PEPCK和G6Pase的mRNA和蛋白相對表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05,P<0.01)，而Ad-shSFRP5組則呈明顯增高(P<0.01)(圖3)。

2.4 Hep1- 6細(xì)胞胰島素信號通路檢測

與Ad-GFP組相比，Ad-SFRP5組胰島素受體(InsR)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平均明顯增強(qiáng)(P<0.01)，而Ad-shSFRP5組相反(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on SFRP5 mRNA and protein expression; B.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on SFRP5 mRNA and protein expression;*P<0.01 compared with Ad-GFP group

3 討論

分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(SFRP5)是一種新型抗炎脂肪因子，它是Wnt信號通路的內(nèi)源性抑制子，可防止代謝紊亂，與機(jī)體代謝具有密切相關(guān)性[5]。SFRP5在小鼠的白色脂肪組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在多種肥胖鼠模型中，脂肪組織中的SFRP5表達(dá)降低[1]。亦有臨床研究報(bào)道，在中國肥胖和2型糖尿病人群中，血漿SFRP5水平呈下降趨勢，是影響機(jī)體糖脂代謝、炎性反應(yīng)和胰島素抵抗的獨(dú)立因素[5- 6]。而肝臟是人體代謝的重要器官，同時(shí)也是胰島素作用的主要靶器官之一，因此，以小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1- 6作為研究載體，旨在探索SFRP5在糖代謝及胰島素應(yīng)答方面的作用。

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on glucose uptake; B.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on glucose uptake;*P<0.01 compared with Ad-GFP group

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on PEPCK and G6Pase mRNA expression; B.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on PEPCK and G6Pase protein expression; C.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on PEPCK and G6Pase mRNA expression; D.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on PEPCK and G6Pase protein expression;*P<0.05,**P<0.01 compared with Ad-GFP group

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on p-InsR/t-InsR and p-AKT/t-AKT; B.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on p-InsR/t-InsR and p-AKT/t-AKT;*P<0.05,**P<0.01 compared with Ad-GFP group

2型糖尿病的主要病因?yàn)橐葝u素抵抗，主要表現(xiàn)為胰島素促使葡萄糖攝取和利用效率降低，機(jī)體代償分泌過多胰島素導(dǎo)致高胰島素血癥。為了探索SFRP5在糖代謝中產(chǎn)生的作用，本研究測定Hepa1- 6細(xì)胞葡萄糖攝取率，結(jié)果顯示SFRP5參與Hepa1- 6細(xì)胞的葡萄糖代謝，SFRP5上調(diào)可以減輕糖代謝負(fù)擔(dān)，而抑制SFRP5則會加重細(xì)胞糖代謝紊亂。

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)和葡萄糖- 6-磷酸酶(G6Pase)是肝臟糖異生途徑的關(guān)鍵酶，被廣泛用于評估肝臟糖異生水平[7- 8]。2型糖尿病通常會出現(xiàn)肝臟糖異生增強(qiáng)，葡萄糖輸出增加。本研究檢測Hepa1- 6細(xì)胞中PEPCK和G6Pase的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，SFRP5過表達(dá)可以抑制肝細(xì)胞糖異生途徑，改善糖代謝紊亂。

為了進(jìn)一步探索SFRP5與胰島素抵抗的關(guān)系，本研究檢測Hepa1- 6細(xì)胞胰島素信號通路的關(guān)鍵因子胰島素受體(InsR)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平變化。結(jié)果表明過表達(dá)SFRP5可以增加胰島素信號通路InsR/AKT的活性，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞胰島素敏感性。

綜上所述，小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1- 6中SFRP5基因過表達(dá)可增強(qiáng)肝細(xì)胞葡萄糖攝取率，減輕肝細(xì)胞糖代謝負(fù)擔(dān)，抑制肝細(xì)胞糖異生途徑，改善糖代謝紊亂，活化經(jīng)典胰島素信號通路，增強(qiáng)胰島素敏感性，改善胰島素抵抗；而抑制SFRP5則呈現(xiàn)相反現(xiàn)象。因此，此次研究結(jié)果顯示，SFRP5在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，可為2型糖尿病提供新的治療靶點(diǎn)，其對糖代謝的具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。