下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂對(duì)焦慮性抑郁模型大鼠海馬結(jié)構(gòu)的影響

凌 佳，吳夢(mèng)瑤，楊 琴，趙洪慶，杜 青，韓遠(yuǎn)山，王宇紅,*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208; 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007; 3.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

焦慮性抑郁(anxious depression)是一種常見的慢性致殘性精神類疾病，主要臨床表現(xiàn)包括脆弱性、強(qiáng)制性、尋求贊許和幻想等[1]。60%～90%的抑郁患者具有焦慮特征，其中50%明確伴有焦慮癥[2]。與單純抑郁癥或焦慮癥相比，焦慮性抑郁疾病具有癥狀重、病程慢、自殺率高和預(yù)后差等特征[3-4]。因此，有效辨別疾病發(fā)病特征和探討內(nèi)在發(fā)病機(jī)制，對(duì)疾病防治具有重要意義。激素分泌紊亂、下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamus pituitary adrenal axis，HPA軸)功能亢進(jìn)是精神類疾病的重要表現(xiàn)[5]。海馬是焦慮和抑郁等精神類疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶區(qū)，同時(shí)也是糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)的高表達(dá)腦區(qū)，更易受到HPA軸所分泌的糖皮質(zhì)激素過表達(dá)的影響。但在焦慮性抑郁中，HPA軸和海馬的結(jié)構(gòu)、功能是否存在同樣變化？與單純的焦慮或抑郁有何聯(lián)系或區(qū)別？目前暫不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用腹腔注射皮質(zhì)酮聯(lián)合束縛應(yīng)激建立焦慮性抑郁大鼠模型，以焦慮和抑郁模型大鼠為對(duì)照，以HPA軸為中心，研究焦慮性抑郁模型大鼠HPA軸相關(guān)組織及激素變化，同時(shí)檢測(cè)海馬GR表達(dá)，擬初步探討焦慮性抑郁的發(fā)病機(jī)制，為疾病的臨床防治提供前期實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，雄性，180～220 g，60只[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK(湘)2013-0004]。

1.1.2 試劑：皮質(zhì)酮(索萊寶公司)；兔抗鼠GR、GAPDH多克隆抗體(Proteintech 公司)；RIPA裂解液和羊抗兔IgG-HRP二抗(博士德公司)；ELISA試劑盒(R&D公司)；蘇木精染液和伊紅染色液(江萊生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組與處理：將60只大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、溶媒組和焦慮組：用不確定性空瓶應(yīng)激法造模[6]。前期進(jìn)行定時(shí)喂水訓(xùn)練，7 d后開始給予空瓶應(yīng)激，隨機(jī)選取某一時(shí)間段作為應(yīng)激時(shí)間點(diǎn)，以空水瓶誘發(fā)情緒應(yīng)激，連續(xù)應(yīng)激14 d；抑郁組：參照文獻(xiàn)[7]給大鼠皮下注射皮質(zhì)酮(40 mg/kg)，持續(xù)注射21 d；焦慮性抑郁組：采用束縛應(yīng)激聯(lián)合皮質(zhì)酮注射(30 mg/kg)法進(jìn)行造模。每天9∶00—15∶00對(duì)大鼠進(jìn)行束縛，束縛完成后給予皮下注射皮質(zhì)酮，共21 d。

造模結(jié)束后，先進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，測(cè)試完成后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，并取各組大鼠下丘腦、垂體、腎上腺和海馬等組織，備用(病理切片是需要多聚甲醛固定的，而Western blot是液氮速凍)。

1.2.2 行為學(xué)測(cè)試：高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze, EPM)：將大鼠頭部正對(duì)封閉臂，于迷宮中央平臺(tái)處放入。釋放后計(jì)時(shí)并記錄以下指標(biāo)：進(jìn)入開放臂次數(shù)(OE)、進(jìn)入封閉臂次數(shù)(CE)、進(jìn)入開放臂時(shí)間(OT)和進(jìn)入封閉臂時(shí)間(CT)。每只測(cè)試5 min。根據(jù)上述指標(biāo)得出：1)進(jìn)入開放臂的次數(shù)比例(OE%)=OE/(OE+CE)×100%；2)開放臂停留時(shí)間比例(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。

曠場(chǎng)測(cè)試(open field test, OFT)：測(cè)試敞箱尺寸為80 cm×80 cm×40 cm，將底面平分為25個(gè)方格。實(shí)驗(yàn)前30 min將待測(cè)大鼠放入測(cè)試間以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠從敞箱中央放入，觀察并記錄4 min內(nèi)大鼠的水平運(yùn)動(dòng)格數(shù)和垂直豎立次數(shù)，計(jì)算水平和垂直得分?jǐn)?shù)總和。

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test, FST)：將大鼠放入H=50 cm和D=20 cm的圓柱形游泳筒中，水深約40 cm，隨機(jī)選擇大鼠進(jìn)行雙盲法檢測(cè)。正式測(cè)試前先適應(yīng)1 min，再記錄4 min內(nèi)大鼠不動(dòng)時(shí)間。動(dòng)物不動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)為大鼠兩前爪停止游動(dòng)，身體呈漂浮狀態(tài)。

1.2.3 HE染色檢測(cè)下丘腦、垂體、腎上腺及海馬病理變化：取材后多聚甲醛固定，常規(guī)制片，顯微鏡下觀察和拍片，分析各組大鼠HPA軸各組織和海馬組織的病理變化。

1.2.4 ELISA檢測(cè)CRH、ACTH和CORT含量：使用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，所有步驟按說明書操作。測(cè)試完成后分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組大鼠血漿中CRH、ACTH和CORT含量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)海馬中GR蛋白含量：取-80 ℃冷凍保存的海馬組織，裂解后于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清得到組織蛋白提取液，定量后備用；根據(jù)目的蛋白分子質(zhì)量選擇對(duì)應(yīng)濃度的分離膠，上樣，電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時(shí)停止電泳；采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗稀釋液(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后采用ECL法顯色。應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，得到相應(yīng)吸光度值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白表達(dá)量的比值作為海馬內(nèi)GR蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

2.1.1 高架十字迷宮測(cè)試結(jié)果：與對(duì)照組或溶媒組相比，焦慮組、抑郁組和焦慮性抑郁組大鼠的OE%和OT%值均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；與抑郁組比較，焦慮性抑郁組大鼠的OE%值升高(P<0.05)(圖1)。

2.1.2 曠場(chǎng)測(cè)試結(jié)果：相較于對(duì)照組，焦慮組和抑郁組大鼠的自主活動(dòng)次數(shù)顯著下降(P<0.05或P<0.01)，焦慮性抑郁模型組大鼠活動(dòng)次數(shù)也顯著下降(P<0.05)(圖2)。

2.1.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組或溶媒組相比，抑郁組、焦慮性抑郁組大鼠的不動(dòng)時(shí)間均顯著增加(P<0.01)；與焦慮組相比，焦慮性抑郁模型組大鼠的不動(dòng)時(shí)間均顯著增加(P<0.01)(圖3)。

2.2 ELISA測(cè)試血漿HPA軸各指標(biāo)含量的結(jié)果

與對(duì)照組相比，各模型組大鼠血漿的CRH、ACTH和CORT含量均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與焦慮組比較，焦慮性抑郁組大鼠CRH、ACTH和CORT含量均顯著上升(P<0.01)；與抑郁組相比，焦慮性抑郁組大鼠CRH、ACTH和CORT含量均顯著上升(P<0.05)(圖4)。

△P<0.05 compared with control group; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01 compared with vehicle group; *P<0.05 compared withdepression group

△P<0.05 compared with control group; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01 compared with vehicle group圖2 各組大鼠曠場(chǎng)測(cè)試中活動(dòng)次數(shù)比較Fig 2 Comparisons of independent activity frequency in OFT in each group

△P<0.05 compared with control group; ▲P<0.01 compared with vehicle group; #P<0.01 compared with anxiety group圖3 各組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間比較Fig 3 Comparisons of immobility time in FST in each group

△P<0.05, ΔΔP<0.01 compared with control group; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01 compared with vehicle group; #P<0.01compared with anxiety group; *P<0.05 compared with depression group

2.3 焦慮性抑郁模型大鼠HPA軸各組織HE染色結(jié)果

正常組和溶媒組大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞分布均一，形態(tài)正常；各模型組大鼠的下丘腦均存在神經(jīng)元胞體腫大和胞核深染等現(xiàn)象，焦慮性抑郁組甚至還出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞丟失和排列紊亂等情況。綜合分析可知，焦慮性抑郁組的損傷情況要比焦慮組和抑郁組更為嚴(yán)重(圖5)。

對(duì)照組大鼠垂體細(xì)胞的間隙正常、分布均勻，可分泌ACTH的嗜堿性細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯病理損傷；各模型組中，大鼠垂體組織均出現(xiàn)嗜堿性細(xì)胞增多和胞體腫脹，排列相對(duì)無序，可能正處于分泌亢進(jìn)狀態(tài)。其中焦慮性抑郁組病變情況最為嚴(yán)重(圖6)。

正常組和溶媒組大鼠腎上腺束狀帶與球狀帶之間的界限清晰，細(xì)胞形狀規(guī)則，排列有序；各模型組大鼠的腎上腺束狀帶和球狀帶界限均出現(xiàn)明顯的模糊化，可分泌CORT的束狀帶細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積變大呈空泡狀，可能正處于功能亢進(jìn)狀態(tài)，其中焦慮性抑郁組束狀帶細(xì)胞病變程度最為嚴(yán)重(圖7)。

2.4 焦慮性抑郁模型大鼠腦內(nèi)海馬HE染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞體豐滿，排列整齊有序；焦慮組和抑郁組大鼠海馬CA1區(qū)均存在一定程度的損傷，具體表現(xiàn)為部分神經(jīng)元丟失，胞體空染，錐體細(xì)胞排列無序化，抑郁組神經(jīng)元丟失情況較焦慮組更嚴(yán)重；焦慮性抑郁組神經(jīng)元缺失明顯，胞體空泡狀現(xiàn)象嚴(yán)重，錐體細(xì)胞排列散亂，整體較抑郁組更為嚴(yán)重(圖8)。

A.control group; B.vehicle group; C.anxiety group; D.depression group; E.anxious depression group圖5 各組大鼠下丘腦HE染色結(jié)果Fig 5 HE staining of hypothalamus in each group(×200)

A.control group; B.vehicle group; C.anxiety group; D.depression group; E.anxious depression group圖6 各組大鼠垂體HE染色結(jié)果Fig 6 HE staining of pituitary in each group(×400)

2.5 焦慮性抑郁模型大鼠海馬GR蛋白的表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，焦慮組、抑郁組和焦慮性抑郁組大鼠海馬GR水平均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；與焦慮組相比，焦慮性抑郁組大鼠海馬GR表達(dá)顯著下降(圖9)。

3 討論

焦慮性抑郁是社會(huì)環(huán)境、心理壓力、病程和遺傳等多因素紊亂共同導(dǎo)致的復(fù)合型精神類疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及多方面主要包括HPA軸紊亂[8]、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)[9]和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏[10]等。在動(dòng)物模型方面，單純的軀體應(yīng)激或藥物刺激尚不能模擬焦慮性抑郁的復(fù)雜性，故需采用復(fù)合模型模擬其臨床發(fā)病特點(diǎn)。本課題組前期采用慢性束縛應(yīng)激(6 h)聯(lián)合皮質(zhì)酮注射(30 mg/kg)成功建立焦慮性抑郁動(dòng)物模型[11]。

A.control group; B.vehicle group; C.anxiety group; D.depression group; E.anxious depression group圖7 各組大鼠腎上腺HE染色結(jié)果Fig 7 HE staining of adrenal gland in each group(×200)

A.control group; B.vehicle group; C.anxiety group; D.depression group; E.anxious depression group圖8 各組大鼠海馬HE染色結(jié)果Fig 8 HE staining of hippocampus in each group(×100)

△P<0.05 compared with control group; ▲P<0.01 compared with vehicle group; #P<0.05 compared with anxiety group圖9 大鼠海馬GR蛋白表達(dá)情況Fig 9 Expression of GR protein in hippocampus of rats

動(dòng)物行為學(xué)表型是精神類疾病實(shí)驗(yàn)研究的常規(guī)指標(biāo)，可為模型評(píng)價(jià)及藥物篩選提供最直接的信息，其中用于評(píng)價(jià)焦慮情緒的有高架十字迷宮測(cè)試、明暗箱實(shí)驗(yàn)、場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等，用于評(píng)價(jià)抑郁情緒的有強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、新奇事物探索和糖水消耗實(shí)驗(yàn)等[12]。本實(shí)驗(yàn)綜合多種行為學(xué)評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)，在EPM中，焦慮性抑郁模型大鼠的OE%、OT%均顯著少于對(duì)照組，與焦慮組結(jié)果類似，表明其具有典型焦慮樣行為；在OFT中，3個(gè)模型組大鼠的活動(dòng)次數(shù)均明顯低于對(duì)照組，但由于該測(cè)試既可用于評(píng)價(jià)焦慮行為，又可用于評(píng)價(jià)抑郁行為，故根據(jù)該結(jié)果可推斷焦慮性抑郁模型大鼠存在一定的焦慮癥狀和一定的抑郁癥狀；在FST中，焦慮性抑郁模型大鼠游泳不動(dòng)時(shí)間較對(duì)照組顯著增加，缺乏求生欲望，抑郁樣行為明顯。由于EPM僅用于評(píng)價(jià)動(dòng)物的焦慮情緒，而抑郁動(dòng)物具有自主活動(dòng)明顯減少的特點(diǎn)，在測(cè)試中僅有少量活動(dòng)，從而出現(xiàn)抑郁組大鼠的在EPM中的OE%、OT%數(shù)值明顯低于溶媒組， 甚至低于焦慮性抑郁組， 即EPM數(shù)據(jù)對(duì)抑郁動(dòng)物沒有分析意義。綜合以上3種行為學(xué)測(cè)試結(jié)果，焦慮性抑郁大鼠具有典型的焦慮樣行為和抑郁樣行為，可判斷本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功。

HPA軸作為反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一，是機(jī)體維持內(nèi)平衡的重要途徑和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的核心樞紐。研究表明，HPA軸功能紊亂是焦慮癥與抑郁癥的共同發(fā)病機(jī)制[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，焦慮性抑郁模型大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞丟失和排列紊亂，垂體嗜堿性細(xì)胞增多和胞體腫脹，腎上腺束狀帶和球狀帶界限不清晰，束狀帶細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈空泡狀，表面以上組織均存在明顯損傷，其損傷程度明顯高于焦慮組和抑郁組，與之對(duì)應(yīng)的分泌激素CRH、ACTH和CORT血漿含量均較對(duì)照組和焦慮組顯著升高，且稍均高于抑郁組，表明焦慮性抑郁狀態(tài)下大鼠體內(nèi)HPA軸確實(shí)處于亢進(jìn)狀態(tài)。

長(zhǎng)期接受慢性應(yīng)激可導(dǎo)致HPA軸基礎(chǔ)活性增高，使腎上腺分泌GC增多，透過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)；而海馬是GR的高表達(dá)腦區(qū)，最易受到GC影響，當(dāng)腦內(nèi)皮質(zhì)醇含量異常升高時(shí)，海馬將率先受到攻擊，影響大腦認(rèn)知功能而導(dǎo)致情緒障礙。作為HPA軸高位調(diào)節(jié)中樞，海馬通過GR對(duì)HPA軸也有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，海馬損傷可進(jìn)一步加重HPA軸功能紊亂[14]。當(dāng)機(jī)體海馬GR表達(dá)下降時(shí)，其對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)作用被削弱，致使HPA軸持續(xù)亢進(jìn)。已有研究表明抗抑郁藥物可通過上調(diào)海馬GR水平而發(fā)揮療效[15]。本實(shí)驗(yàn)表明，焦慮性抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元缺失和萎縮、胞體空染和GR蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下降，提示焦慮性抑郁狀態(tài)下海馬結(jié)構(gòu)損傷和GR表達(dá)下降。因此，焦慮性抑郁大鼠HPA軸的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生變化，并以GR為連接波及海馬，引起海馬結(jié)構(gòu)受損。

綜上所述，在焦慮性抑郁狀態(tài)下，HPA軸組織病變和功能亢進(jìn)，波及富含GR受體的海馬，致使海馬組織結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致動(dòng)物行為表現(xiàn)異常，同時(shí)海馬GR蛋白表達(dá)下降，從而降低HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)功能，造成惡性循環(huán)，加重疾病的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)將進(jìn)一步研究焦慮性抑郁的深層發(fā)病機(jī)制，為篩選治療藥物提供前期基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。