1例保育仔豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李志勇，劉勝春，熊云云，熊莉娟

（1.進(jìn)賢縣畜牧獸醫(yī)局，江西 南昌 331500；2.江西省職業(yè)病防治研究院）

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌 (Streptococcus suis，SS)引起的一種人畜共患急性、熱性傳染病。急性主要表現(xiàn)為敗血癥和腦膜炎，發(fā)病率和死亡率均較高，慢性主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等，其死亡率相對較低［1～2］。 該病分布較為廣泛，是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3～4］。 根據(jù)不同的群特異性抗原，蘭氏(Lancefield)分類法將鏈球菌分為20個血清群；按照莢膜多糖的差異，豬鏈球菌可分為35個血清型 (1型-34型和1/2型)，可引起豬和人發(fā)病的血清型包括2、1、9、7和8等，臨床上以豬 2 型鏈球菌為主［5～6］。

2017年12月，江西省南昌市某規(guī)模化豬場的保育仔豬出現(xiàn)急性死亡現(xiàn)象，臨床癥狀主要為體溫升高，倒地四肢劃水等神經(jīng)癥狀，死亡率約10%。本文通過對該場送檢病豬病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，最終確診由豬鏈球菌感染引起。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇高度敏感藥物阿莫西林進(jìn)行治療，取得較好防治的效果。

1 材料與方法

1.1 病料來源

來源于江西省南昌市某規(guī)模化豬場送檢1頭發(fā)病保育仔豬肺臟、肝臟、腦等組織。

1.2 主要試劑

含10%小牛血清的TSA平板和TSB液體培養(yǎng)基均為自行配制；藥敏紙片和細(xì)菌生化鑒定管購于杭州天和微生物試劑有限公司。PCR反應(yīng)試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，膠回收試劑盒、DNA marker（D2000）購自天根生化（北京）有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離純化

無菌操作，對送檢病豬肺臟、肝臟和腦分別進(jìn)行細(xì)菌分離，劃線接種于含10%小牛血清的TSA平板，37℃燭缸培養(yǎng)24h；挑取均勻一致的單個菌落進(jìn)行一輪純培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色鏡檢。

1.4 生化鑒定

取純培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，分別接種到生化鑒定管中，37℃燭缸培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果，參照生化鑒定管說明書確定結(jié)果。

1.5 PCR

根據(jù)豬鏈球菌16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)1對檢測引物。引物序列：上游引物F∶5'-TGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')； 下游引物 R：5'-CTA CCA GGG TAT CTA ATC CT-3'，預(yù)期片段大小為1500bp，引物由金斯瑞生物科技公司合成。

將純培養(yǎng)的單個細(xì)菌菌落接種到5mL含10%小牛血清的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取適量菌液，3000 r/min離心5 min，棄上清，用200 μL TE緩沖液重懸菌體，煮沸10 min，離心，以上清作為待測DNA模板。

PCR 反應(yīng)體系 （50 μL） ∶10× Buffer 5 μL，dNPTs 4 μL，Taq 酶 0.5μL，DNA 1μL，上、下游引物各 0.5μL，ddH2O 38.5 μL。PCR 反應(yīng)條件∶94 ℃預(yù)變性5min，32個循環(huán) （94℃變性30 s，54℃ 退火 30 s，72℃ 延伸1min）；最后72℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，送金斯瑞生物科技公司測序。

1.6 藥敏試驗(yàn)

挑取分離純化的單個菌落接種于5mL的含10%小牛血清的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取200μL培養(yǎng)菌液均勻涂布于含10%小牛血清的TSA平板，無菌操作，將藥敏紙片平貼于培養(yǎng)基表明，37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病理變化

剖檢1頭發(fā)病保育仔豬，發(fā)病豬呈四肢劃水等神經(jīng)癥狀（圖1），心外膜表面有點(diǎn)狀或塊狀出血，胸腔和心包積液，肝臟未見明顯病變，脾臟邊緣有梗死。

圖1 發(fā)病保育仔豬

圖2 分離菌株培養(yǎng)形態(tài)

圖3 分離菌株1革蘭氏染色

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

在含10%小牛血清的TSA平板上37℃燭缸培養(yǎng)24 h，可見從腦中分離出一株小型圓形隆起，透明，邊緣整齊，表面光滑、稍粘稠的灰白色菌落（如圖2）。革蘭氏染色為陽性球菌，成雙球或短鏈狀排列（圖 3）。

2.3 PCR測序結(jié)果

對分離菌株提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，能擴(kuò)增到約1500bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致（圖4）。將測序序列于NCBI進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明，該產(chǎn)物為豬鏈球菌16S rRNA序列。

圖4 分離菌株16S RNA擴(kuò)增電泳圖M：D2000；1：分離菌株

2.4 細(xì)菌生化特性鑒定結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株能分解蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖，不能分解山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖和麥芽糖，尿素反應(yīng)為陰性，明膠液化為陰性（見表1）?；痉湘溓蚓纳囵B(yǎng)特征 （陸承平，2008）［7］。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離鏈球菌菌株對阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢唑啉等高度敏感，對哌拉西林、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星等為中度敏感，對慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明等不敏感（如表2）。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

綜合該規(guī)?；i場保育豬的流行病學(xué)、病理剖檢，并最終通過細(xì)菌生化鑒定和PCR鑒定，確診造成該場仔豬急性死亡的原因?yàn)樨i鏈球菌引起。

敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離鏈球菌菌株對阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢唑啉等高度敏感，對哌拉西林、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星等為中度敏感，對慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明等不敏感，與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［3］。通過選擇高度敏感藥物阿莫西林進(jìn)行治療，取得明顯效果，后續(xù)未出現(xiàn)新的病例。該場在前期使用過氟苯尼考和磺胺類藥物進(jìn)行防控，但效果不理想。因此，在臨床治療過程中不要盲目用藥，最好先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，再選擇敏感藥物進(jìn)行使用，一方面防止延誤治療，另一方面防止耐藥性的產(chǎn)生。

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化、集約化的發(fā)展，加上豬圓環(huán)病毒病、豬藍(lán)耳病等免疫抑制性疾病的發(fā)生，使得豬鏈球菌病成為豬場重要的細(xì)菌性疾病之一，在部分豬場呈現(xiàn)散發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，值得引起重視。臨床上該病的防制應(yīng)注重以預(yù)防為主的方針，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，清潔豬舍環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒，加強(qiáng)通風(fēng)，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出的原則等；此外，還應(yīng)做好其它病毒性疫苗的免疫。