藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)法研究異歐前胡素溶出特征及與體內(nèi)藥代動力學(xué)相關(guān)性分析

徐雪芳，李超，王洋洋，黃聰，何新，4

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院；3.天津凱萊英生命科學(xué)技術(shù)有限公司；4.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193)

白芷為傘形科植物白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.]的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有2000多年的藥用歷史，為中醫(yī)臨床常用中藥之一[1]。異歐前胡素作為白芷的主要活性成分，其藥代動力學(xué)研究多通過高效液相色譜(HPLC)分析[2-4]，由于血漿樣品多存在含量低，成分復(fù)雜等問題，建立更為靈敏、特異、及快速的分析方法尤其重要，本研究擬建立該藥物的UPLC-MS/MS分析法[5]，并將該方法應(yīng)用于異歐前胡素的藥代動力學(xué)研究。

藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)(drug dissolution/absorption simulating system，DDASS)是近幾年發(fā)明出來的一種連續(xù)性的動態(tài)仿生系統(tǒng)[6]，可用來預(yù)測藥物在體內(nèi)的溶出和吸收程度。He等成功應(yīng)用該系統(tǒng)預(yù)測水溶性藥物、酯化前體藥物及pH依賴性可溶藥物的口服吸收[7-10]。Li等基于對DDASS的改進，將研究對象擴大到片劑、軟膠囊和硬膠囊等多種劑型，用于口服固體制劑體內(nèi)溶出和吸收特征的同步預(yù)測[11-13]。本研究也同時將通過DDASS對異歐前胡素的溶出行為進行評價，以期為其藥代動力學(xué)行為提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC-MS/MS聯(lián)用儀(美國WATERS公司)，色譜工作站： Waters EmpowerTM-MassLynxTM；Allegra 64R 高速離心機(美國BECKMAN公司)；WH-3 微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；AX205十萬分之一天平(瑞士Mellter Toledo公司)；Millipore Milli-Q∕30 L超純水機(法國Millipore公司)；海爾-86 ℃超低溫保存箱(中國海爾)；OA-SYSTMHeating System(USA)；N-EVAPTM111 Nitrogen Evaporator(USA)。異歐前胡素(圖1A)純度98.0%購置于天津馬克生物技術(shù)有限公司(天津，中國)。佛手柑內(nèi)酯(圖1B)作為內(nèi)標物，購置于南京澤朗醫(yī)藥有限公司(南京，江蘇，中國)。色譜純乙腈購置于迪馬科技有限公司(美國)。其它分析純化學(xué)試劑均購置于康科德科技有限公司(天津，中國)，溶劑經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜濾過并脫氣。超純水通過Milli-Q系統(tǒng)制備(Millipore，Billerica，MA)。

1.2 動物

雄性Wistar大鼠10只、平均重量(220±20) g，購于天津?qū)嶒瀯游镏行摹嶒炃?2 h禁食，自由飲水。

1.3 儲備溶液的制備

精密稱定異歐前胡素、內(nèi)標-佛手柑內(nèi)酯標準品，溶劑為甲醇，配制成1.0 mg/mL的儲備液。用甲醇稀釋、制備系列異歐前胡素標準溶液(含1 μg/mL的內(nèi)標物)，濃度分別為20，40，100，200，500，1 000，2 500和5 000 ng/mL。置4 ℃冰箱保存。

血漿樣品中加入適當量的標準溶液制備濃度為4，8，20，40，100，200，500和 1 000 ng/mL的異歐前胡素的系列標準品。以相同的方式制備濃度為4，20，200和800 ng/mL異歐前胡素的質(zhì)量控制樣品，分析前存儲于-20 ℃。標準品和質(zhì)量控制樣品均在每日分析前制備。

1.4 血漿樣品的處理

血漿樣品(100 μL)中加入20 μL內(nèi)標物(1 000 ng/mL)。血漿經(jīng)8倍乙酸乙酯萃取，混合物經(jīng)渦旋震蕩、在4 ℃下、14 000 rpm離心10 min。抽取上層有機層750 μL溶液轉(zhuǎn)移至其他試管中，在室溫、真空下蒸發(fā)至干燥。用100 μL甲醇溶液復(fù)溶，渦旋混合1 min，離心，5 μL上清液進樣。

2 方 法

2.1 色譜條件

異歐前胡素的溶解性和穩(wěn)定性研究采用HPLC-UV方法：安捷倫ODS C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm × 5 μm)；流動相是乙腈-水(75/25)，流速1.0 mL/min，30 ℃；紫外波長305 nm下監(jiān)測流出物，進樣體積10 μL，線性范圍是0.002～0.500 mg/mL。

血漿樣本分析色譜條件：Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm × 100 mm × 1.7 μm)色譜柱，柱溫30 ℃。自動進樣器溫度4 ℃，進樣體積5.0 μL。流動相A：乙腈，B：水(0.05%甲酸)，梯度洗脫程序如下：0～1 min，70%～90% A相；1～4.8 min，90% A相；4.8～5.0 min，A溶劑線性變化由90%～70% A相，5.0～5.5 min，70% A相。

質(zhì)譜分析采用ESI正離子并設(shè)定MRM模式。源溫：80 ℃，脫溶劑溫度：110 ℃，毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓50 V，脫溶劑氣流速650 L/h。錐孔氣和脫溶劑氣為氮氣。IO：m/z 271.02→202.9，IS：m/z 216.9→173.7。IO和IS最佳碰撞能量分別是15和30 eV。

2.2 方法學(xué)考察

根據(jù)FDA生物方法驗證指南[14]對異歐前胡素進行方法學(xué)考察，考察內(nèi)容包括專屬性、線性、范圍、準確度、精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

2.2.1 專屬性 通過比較10只大鼠空白血漿與分別含有異歐前胡素(4.0 ng/mL)和內(nèi)標物(200 ng/mL)血漿的色譜圖來評價該方法的專屬性。

2.2.2 線性和靈敏度 每日樣品分析前制備標準曲線。使用標準濃度為4.0，8.0，20，40，100，200，500和1 000 ng/mL制備該曲線。標準曲線以異歐前胡素與內(nèi)標物峰面積的比值與異歐前胡素的濃度進行線性回歸。

最低定量限(LLOQ)是信號與噪音的比值等于10時異歐前胡素的濃度，也是標準曲線最低濃度。

2.2.3 準確度和精密度 質(zhì)量控制樣本濃度為4.0，20，200和 800 ng/mL，準確度用質(zhì)量控制樣本實際測得的濃度與理論濃度的比值來表示。精密度由質(zhì)量控制樣本的相對標準偏差來表示。

2.2.4 提取回收率 使用質(zhì)量控制樣品測定提取回收率，并通過相同標準濃度下經(jīng)提取的血漿樣本和未經(jīng)提取的標準樣本的峰面積的比值進行計算。內(nèi)標物的提取回收率用類似的方法計算。

2.2.5 基質(zhì)效應(yīng) 通過含有化合物的無藥物血漿樣品與溶解在甲醇中相同濃度化合物樣品的峰面積比值來評估異歐前胡素和內(nèi)標物的基質(zhì)效應(yīng)。分別對5個樣品在不同濃度下(20，200，800 ng/mL)進行分析。

2.3 大鼠體內(nèi)異歐前胡素的藥代動力學(xué)研究

10只大鼠稱重，分別以50 mg/kg的量給予異歐前胡素。異歐前胡素溶液用含3%的吐溫80溶解制備，灌胃給藥。血漿樣品分別于給藥后的0.2，0.35，0.5，0.75，1.0，1.5，2.5，3.5，5.0，8.0和12 h取樣并放置于肝素化的試管中，在3 000 rpm下離心15 min，4 ℃。離心后抽取上清液100 μL移至1.5 mL的Eppendorf試管中，20 ℃保存，直到分析。

2.4 不同pH值下異歐前胡素穩(wěn)定性研究

觀察不同pH值下異歐前胡素的穩(wěn)定性，用濃度1 mg/mL甲醇儲備液制備濃度200 ng/mL異歐前胡素的水溶性緩沖液，在溫度37 ℃下溫育2 h。緩沖液的pH分別為2.0，4.0，6.0和 8.0。分別于20，30，50，70，90和120分鐘整點收集溶液，通過每一時間點下峰面積與0點時峰面積之比來監(jiān)測異歐前胡素降解程度。

2.5 異歐前胡素的溶解性和溶出度研究

口服藥物制劑活性成分的溶解性在藥物篩選中為關(guān)鍵因素之一，在進行溶出研究前，需要在仿生腸液中測定(pH 6.8)異歐前胡素的溶解性，將其加入10 mL液體中，恒溫搖床溫育2 h，整體積樣品移出，過濾，在高效液相色譜下定量。

藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)(圖2)中溶液均由蠕動泵控制流速，流速為0.5 mL/min。藥液轉(zhuǎn)移至擴散膜一側(cè)的供給室內(nèi)。在溶出研究中，供給室內(nèi)的溶液每隔10 min采集1次。異歐前胡素投藥量為(5.0±0.5 )mg(n=3)。樣品通過高效液相色譜進行分析。

2.6 數(shù)據(jù)分析

一級消除速率常數(shù)K按照下面的方程計算：

C0是藥物的初始濃度，Ct是在時間點t時的剩余濃度。

大鼠體內(nèi)異歐前胡素的藥代動力學(xué)參數(shù)通過WinNonlin軟件(Phoenix WinNonlin 6.0，Pharsight Corp.，Cary，NC，USA)計算。所得數(shù)據(jù)以均值±標準差(SD)表示。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性 方法專屬性結(jié)果如圖3所示，異歐前胡素和內(nèi)標物的保留時間分別為4.3和3.26分鐘，該時間沒有內(nèi)源性干擾物。

3.1.2 準確度和精密度 濃度為20，200和 800 ng/mL異歐前胡素的準確度和精密度見表1。不同濃度下的精密度的相對標準偏差范圍分別為6.8%～8.0%。準確度范圍為-15.3%～0.64%。結(jié)果表明，該方法準確度、精密度和重現(xiàn)性均符合要求。

表1 精密度和準確度[n=5，(均值±SD)ng/mL)]

3.1.3 提取回收率 異歐前胡素和內(nèi)標物的提取回收率見表2。在4.0，20，200和 800 ng/mL濃度下，平均回收率大于50%，符合要求。

表2 異歐前胡素及內(nèi)標物提取回收率考察結(jié)果(n=5)

3.1.4 基質(zhì)效應(yīng) 絕對基質(zhì)效應(yīng)通過血漿樣品與溶解在甲醇中濃度為20，200和 800 ng/mL的異歐前胡素(n=5)和濃度為200 ng/mL內(nèi)標物(n=5)峰面積比值來表示?？瞻籽獫{樣品加入標準化合物備用，未發(fā)現(xiàn)明顯的基質(zhì)效應(yīng)(見表3)。

表3 異歐前胡素及內(nèi)標物基質(zhì)效應(yīng)(n=5)

3.2 藥代動力學(xué)應(yīng)用

異歐前胡素在大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線見圖5。經(jīng)WinNonlin 6.1軟件，采用非房室模型擬合藥代動力學(xué)參數(shù)。異歐前胡素相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。給藥后(45±0.18)min，異歐前胡素達峰濃度，Cmax為(0.26±0.002)μg/mL。隨后的1.5 h內(nèi)血藥濃度迅速下降，且在給藥后1.5～12 h內(nèi)消除速率趨于緩慢。血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-last)為(27.9±0.11)min·μg/mL。異歐前胡素(Vz/F)為(543.7±4.79)L/kg，表明其在組織內(nèi)分布廣泛。

3.3 不同pH下異歐前胡素穩(wěn)定性

不同pH條件下異歐前胡素含量逐漸下降，在pH為2.0時下降尤為顯著。120 min后，異歐前胡素的含量僅為24.9%；在pH為4.0、6.0和8.0時，剩余量分別為68.9%，64.7%和 53.5%，見圖4A。在色譜分析中，檢測到一種未知化合物(見圖4B和C)。在pH為2.0和8.0的條件下，隨著異歐前胡素的量逐漸下降，未知化合物的峰面積逐漸增加。該種未知化合物可能是一種降解產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)還有待進一步驗證。在不同pH下觀察到的K范圍分別是kpH=2.0kpH=8.0kpH=6.0kpH=4.0。根據(jù)所觀察到的降解速率，pH值的順序為pH 2.0pH 8.0pH 6.0pH 4.0。因此，異歐前胡素在酸性和堿性環(huán)境下是不穩(wěn)定的，它的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致了低血藥濃度。

表4 異歐前胡素主要藥代動力學(xué)參數(shù)(n=10)

3.4 異歐前胡素溶出特性

通過400多分鐘觀察，從DDASS研究中獲得異歐前胡素不規(guī)則溶出曲線(見圖6)，累積溶出百分率僅為(0.046±0.02)%，其累積溶出百分率與異歐前胡素不溶于水的特性一致。

4 討 論

根據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharma-ceutics classification system，BCS)，異歐前胡素屬于BCSII 類化合物，其具有低溶解度和高滲透特性。該類化合物的緩慢溶解可能是其吸收的限速步驟。為此，能夠準確、快速的研究藥物的溶出特征尤為重要。

本研究應(yīng)用的DDASS法優(yōu)勢在于不僅考慮到胃腸道內(nèi)急劇的pH變化，并且可以連續(xù)模擬藥物在胃內(nèi)的溶解過程，結(jié)果表明異歐前胡素的累積溶出百分率僅為(0.046±0.02)%，與大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)特征達峰血藥濃度較低[Cmax=(0.26±0.002)μg/mL]，組織分布廣泛 [Vz/F=(543.7±4.79)L/kg]等特征相符；通過在不同pH下的穩(wěn)定性研究表明，隨著pH值變化異歐前胡素含量減少，分別在2.0和8.0時不穩(wěn)定性尤為明顯(圖5)。由此可以推斷異歐前胡素血藥濃度低，與其不穩(wěn)定性和低溶解性有關(guān)，DDASS法能夠快速、準確的為藥代動力學(xué)行為提供依據(jù)。

(此文圖1-6見附頁1-2)

文見第1-4頁

A:異歐前胡素;B:佛手柑內(nèi)酯圖1 異歐前胡素和佛手柑內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)圖圖2 藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)

A：空白血漿；B：供試品色譜圖
圖3 異歐前胡素和佛手柑內(nèi)酯與空白血漿供試品色譜圖

圖4不同pH下異歐前胡素降解時程(A)及在pH 2.0(B)和pH 8.0(C)下的實時色譜

圖5異歐前胡素大鼠灌胃后血藥濃度-時間曲線(n=10)

圖6 在DDASS供給室內(nèi)異歐前胡素的溶出過程