肝癌組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、mTOR的表達及意義

李 芳 徐 萍 高婷婷 陳 偉

(江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

肝癌居我國惡性腫瘤發(fā)病率第四位，死亡率居第二位〔1〕。目前對于肝癌的發(fā)生發(fā)展機制研究有限。自噬作為真核生物獨有的生命現(xiàn)象與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但與肝癌的關(guān)系尚不清楚〔2〕。自噬相關(guān)基因Beclin1參與磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)復(fù)合物和自噬體的組成，在調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3是酵母Atg8基因的同源基因，其表達水平與自噬活性有關(guān)，可作為自噬的特異性診斷指標之一〔3〕。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是PI3K家族成員，與細胞增殖、腫瘤血管的形成明切相關(guān)，在腫瘤細胞中常呈高表達〔4〕。本研究分析自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、mTOR在肝癌中的表達情況及其與患者臨床病理指標的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1樣本來源 2015年4月至2017年10月于鹽城市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的肝癌組織49例，由兩位病理醫(yī)生經(jīng)雙盲法重新閱片診斷，均經(jīng)病理切片HE染色確診為肝癌。納入標準：①結(jié)合臨床癥狀和體征、腹部CT、MRI、實驗室檢查等確診為原發(fā)性肝癌，并符合《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準》〔5〕中的相關(guān)診斷標準。②所有病例為首次發(fā)現(xiàn)，術(shù)前未行放、化療及其他生物免疫治療。排除標準：①腎功能障礙者；②合并嚴重免疫系統(tǒng)疾?。虎酆喜⑵渌麗盒阅[瘤；④合并全身嚴重感染患者。其中男38例，女11例；年齡35～78(中位62)歲；按Edmondson分級標準：Ⅰ級7例，Ⅱ級10例，Ⅲ級22例，Ⅳ級10例。腫瘤直徑> 5 cm者29例，≤5 cm者20例；乙肝表面抗原(HBSAg)陽性者36例；甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L者26例；中、高分化者13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者39例；病理分級Ⅰ～Ⅱ級者17例；有轉(zhuǎn)移者10例；有膽管癌栓者9例。另選取癌旁5 cm外正常肝組織38例作為對照組。

1.2試劑材料 Beclin1、mTOR兔多克隆抗體均購自Abcam公司，兔LC3多克隆抗體、通用型免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測試劑盒、檸檬酸及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3研究方法 (1)采用SP免疫組織化學(xué)技術(shù)，操作嚴格按照說明書進行。主要包括：石蠟切片脫蠟后用胰酶抗原修復(fù)，滴加過氧化酶阻斷液封閉10 min，后用10%非免疫動物血清孵育40 min。滴加Beclin1抗體、LC3抗體或mTOR抗體于4℃過夜。隨后用鼠抗兔二抗孵育20 min，DAB顯色。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，用已知的肝癌陽性片為對照。(2)Beclin1、LC3和mTOR均以細胞膜和(或)細胞質(zhì)染為淡黃、棕黃或棕褐色為陽性。采用染色強度和陽性細胞百分率相結(jié)合來判定。染色強度：無著色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐色3分。陽性細胞百分比：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%者計3分。兩者相乘為總分，≥4分計為免疫組織化學(xué)陽性(+)，<4分為陰性(-)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行Spearman等級分析及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肝癌組織和正常肝組織中Beclin1、LC3和mTOR表達比較 Beclin1、LC3和mTOR主要表達于肝癌細胞的細胞質(zhì)中，為黃色或者棕黃色顆粒，在正常肝組織中多為陰性。肝癌組織標本中，Beclin1、LC3、、mTOR陽性表達率〔37例(75.5%)、31例(63.3%)、23例(46.9%)〕均明顯高于癌旁組織〔9例(23.7%)、13例(34.2%)、10例(26.3%)，χ2=56.092、45.263、53.240，P=0.000、0.010、0.074〕。

2.2肝癌組織中Beclin1、LC3和mTOR陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系 Beclin1、LC3和mTOR的陽性表達僅與病理分級和有無膽管癌栓有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、HBSAg、AFP、分化程度、TNM分期、是否轉(zhuǎn)移等均無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 Beclin1、LC3和mTOR陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3肝癌組織中Beclin1、LC3和mTOR表達相關(guān)性 肝癌組織中Beclin1與LC3的表達呈正相關(guān)(r=0.578,P<0.01)，LC3與mTOR的表達呈負相關(guān)(r=-0.403,P<0.05)，而Beclin1與mTOR的表達無關(guān)(r=-0.113,P>0.05)。

3 討 論

自噬是真核細胞的程序性死亡，是體內(nèi)多余的蛋白質(zhì)、細胞器等亞細胞成分在體內(nèi)分解代謝的過程〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，自噬不僅可以通過清除受損細胞器、抑制細胞生長、啟動細胞程序性死亡等過程來抑制腫瘤細胞增殖，且在饑餓、缺氧等病理生理狀態(tài)下還可能通過誘發(fā)自噬來增強腫瘤細胞的耐受性，從而促進腫瘤發(fā)生〔7〕。肝癌是高度缺氧、缺血的實體腫瘤，推測自噬在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演了一定角色。

Beclin1基因是哺乳動物酵母ATG6基因的同源基因，余招焱等〔8〕研究也報道在胃癌組織中Beclin1的表達顯著低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通常認為Beclin1是一種腫瘤抑制基因，但本研究結(jié)果顯示Beclin1在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，同時Beclin1蛋白僅與病理分級和有無膽管癌栓有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、HBSAg、AFP、分化程度、TNM分期、是否轉(zhuǎn)移等均無關(guān)。分析認為，高病理分級及膽管癌栓可能造成腫瘤的缺血、缺氧狀態(tài)，而自噬可減輕腫瘤的缺血、缺氧狀態(tài)，增強腫瘤的耐受性及抵御不良生存環(huán)境的能力。段昌虎等〔9〕研究也表明，Beclin1在肝癌組織中呈高表達，提示Beclin1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用有重要意義，可能有助于疾病的診斷及靶向治療。

LC3基因主要有Ⅰ型與Ⅱ型兩種形式。LC3Ⅱ是LC3Ⅰ經(jīng)過泛素樣加工后的蛋白水解衍生物，主要參與自噬泡及自噬體的形成，是自噬體的標志分子〔3〕。但是LC3的表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系還存在爭議。韓冰等〔10〕報道在口腔鱗癌中LC3陽性率為29%，顯著低于正常黏膜組95%，而Othman等〔11〕則發(fā)現(xiàn)LC3Ⅰ和LC3Ⅱ在乳腺癌中的表達顯著高于正常組織。本研究結(jié)果顯示，LC3在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，說明LC3存在上調(diào)和下調(diào)兩種機制，在不同類型的腫瘤中發(fā)病機制不同，其分子機制還有待進一步探究。

mTOR是一種進化上保守的蛋白激酶，參與多種信號通路，在腫瘤中常高表達，其活化可以促進細胞周期的進展、血管增殖，從而促進腫瘤的形成。有研究表明，mTOR乳腺癌、小細胞肺癌、白血病等多重腫瘤中均存在高表達〔12～14〕。李帥帥等〔15〕研究也表明，mTOR參與人肝癌細胞BEL-7402中的Cox-2的表達，從而促進細胞增殖、抑制凋亡、促進腫瘤血管的生成等。本研究結(jié)果也顯示，mTOR在肝癌組織中表達的陽性率高于正常組織，說明肝癌組織中存在mTOR的異常激活，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。

本研究分析肝癌組織中Beclin1、LC3和mTOR表達的相關(guān)性，結(jié)果說明Beclin1過表達能促進肝癌細胞的自噬，而mTOR的過表達能抑制自噬，二者可能通過不同的信號通路調(diào)節(jié)自噬。自噬調(diào)控途徑中Ⅰ型PI3K與Ⅲ型PI3K發(fā)揮重要作用。Beclin1基因通過與Ⅲ型PI3K和VPS15的結(jié)合，調(diào)節(jié)PI3K的活性，促進自噬作用，而mTOR則接受上游的Ⅰ型PI3K信號通路的調(diào)控，磷酸化下游的兩個分子即4E-BP1和S6K1，來抑制自噬的發(fā)生〔16〕。

本研究初步揭示肝癌中自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3和mTOR的表達情況，為進一步研究腫瘤自噬活性調(diào)節(jié)的分子機制及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程提供了重要方法及途徑。