小麥籽粒響應花后早期高溫脅迫的形態(tài)和細胞學研究

馮寬 ，李詠 ，林靜 ，趙云 ，石培春 ，李召鋒 ，李衛(wèi)華 *

（1石河子大學農(nóng)學院/新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆 石河子832003；2哈密市巴里坤縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，新疆 哈密 839000）

小麥（Triticum aestivumL.）是我國重要的糧食作物，小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)的形成不僅受遺傳特性等內(nèi)在因素的影響，而且與生態(tài)環(huán)境和栽培措施等一系列手段密切相關[1]。溫度和水分是影響小麥生長的重要因素，對籽粒貯藏物質(zhì)的形成具有極其重要的作用。小麥籽粒發(fā)育的適宜溫度為20-24℃[2]，高溫是新疆地區(qū)小麥灌漿期遭受的主要災害之一，6月上旬至6月下旬經(jīng)常遭遇干熱風天氣，此時節(jié)正值小麥開花至乳熟期，大氣溫度驟升，日最高溫度達35℃[3]，容易導致籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)下降。小麥籽粒形成期，高溫導致籽粒發(fā)育不良，葉片葉綠體受損，葉綠素降解，植株衰老加速，灌漿期縮短，產(chǎn)量下降[4]。在一定范圍內(nèi)小麥成熟期的平均溫度與成熟期的長短之間存在負相關[5]。灌漿期間日平均氣溫15.8-27.7℃范圍內(nèi)日均溫每增加1℃，粒灌漿持續(xù)時間縮短3.1 d，粒重下降2.8 mg[6-8)。封超年等[9]研究發(fā)現(xiàn)，花后不同時期高溫處理在短時間提高胚乳細胞分裂速率。王磊等[10]研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的熱激可以誘導煙草產(chǎn)生PCD，隨著熱激處理溫度的升高，DNA已經(jīng)開始解體，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。前人著重研究高溫對小麥籽粒灌漿速率及最終產(chǎn)量的影響，但對花后不同生育期籽粒發(fā)育動態(tài)及細胞學的影響報道較少。

因此，本研究應用人工氣候室培養(yǎng)盆栽小麥，在花后5-8 d進行高溫處理，探討花后早期高溫脅迫下小麥籽粒形態(tài)學、細胞學變化，以期明確小麥籽粒響應花后高溫脅迫的生理機制。揭示花后高溫脅迫對小麥籽粒形態(tài)和細胞學的影響，為小麥響應逆境脅迫提供一定理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為新疆主栽春性、中熟小麥品種新春11號，由石河子大學麥類作物研究所提供，實驗用種均來自2016年夏天收獲的種子。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計

實驗于2016年9月至12月在石河子大學綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室人工氣候室（日平均氣溫20℃-25℃）中采用盆栽進行。盆直徑25 cm，深30 cm，盆土為基質(zhì)∶蛭石=3∶1混合而成，每盆土重 1.5 kg左右。測得土壤全氮含量1.1 g/kg，速效磷含量為38.49 mg/kg，速效鉀含量126.39 mg/kg，于三葉期、拔節(jié)期和灌漿初期結合澆水每盆分別追施二胺、尿素和硫酸鉀，施肥量同中等產(chǎn)量水平田間正常管理用量，其它管理措施按小麥常規(guī)栽培技術規(guī)程進行。播種時每盆播20粒種子），播種后2周間苗，每盆保留8～10棵苗。標記生長一致且同天開花的單穗（每穗有2～3個小穗有花藥抽出即標記為開花）作為實驗材料，于花后5 d將材料移入溫光可控培養(yǎng)箱進行高溫處理（High Temperature，HT），處理期晝/夜溫度為35/18℃，于正午12：00開始處理至下午17：00結束，連續(xù)處理至花后8d，處理結束后移至人工氣候室正常生長。未進行高溫處理的材料作為對照（Control，CK），分別于花后 10、15、20、25 d 和 30 d取樣，剝?nèi)∷胫邢虏孔蚜＃鲿r期籽粒置于液氮中速凍30 min，于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 測定項目

1.2.2.1 籽粒長、寬、厚的測定

剝?nèi)←溗胫邢虏啃∷氲膬?yōu)勢粒，隨機選取10粒小麥籽粒，將籽粒首尾相接排成一行，測定其長度，以10粒籽粒的平均值作為單個籽粒的長度（mm），重復測定三次；10粒籽粒其肩并肩排列成一行，測定其長度，重復測定三次，最后求平均值，作為單籽粒的寬度（mm）；在背景紙上貼上雙面膠，然后將種子側(cè)放在雙面膠上，測定其厚度，重復測定3次，最后求平均值作為籽粒的厚度（mm）。

1.2.2.2 籽粒鮮、干重的測定

隨機數(shù)取各時期籽粒100粒，稱取其鮮重；然后105℃烘15 min殺青，70℃烘8 h左右至恒重，測定籽粒干重。各時期材料3次重復測定。

1.2.2.3 胚乳細胞數(shù)目測定

采用郭文善等[11]胚乳細胞簡易計數(shù)方法進行。

1.2.2.4 穎果發(fā)育的觀察

參照康海岐等[12]方法，采用石蠟切片法進行籽粒組織結構觀察，將制成的切片在裝有CCD相機的光學顯微鏡（DMLS，德國LEICA公司）下觀察并拍照。每組選取小穗中下部3個穎果作為重復，每個穎果來自不同麥穗。

1.2.2.5 Evans Blue染色檢測胚乳PCD發(fā)生位置

染色方法參照Young等[13]的文獻方法。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用WPS Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖，用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行各指標的方差分析和顯著性檢驗。圖表的制作采用Photoshop圖像處理軟件。

2 結果與分析

2.1 花后高溫對小麥籽粒形態(tài)的影響

2.1.1 花后早期高溫對小麥籽粒形態(tài)和粒徑的影響

小麥籽粒發(fā)育過程穎果形態(tài)變化如圖1所示，隨籽粒發(fā)育進程，顏色逐漸由綠變黃，高溫處理后的籽粒顏色由綠轉(zhuǎn)黃開始較早，且程度較深，尤其花后30 d顏色變化明顯。籽粒體積變化除花后10 d大于對照外，其它各時期籽粒體積均小于對照，具體籽粒長、寬、厚度的變化見圖1。

圖1 籽粒發(fā)育不同時期籽粒顏色和形態(tài)變化Fig.1 Grain color and morphological changes in different stages of grain development

從圖1中可以看出，花后早期高溫顯著影響小麥籽粒粒徑，籽粒長、寬、厚均于花后25d達最大值，此后粒徑有一定程度減?。▓D2-A、B、C）。花后10d高溫處理小麥籽粒長、寬顯著大于對照，分別比對照高2.52%、6.98%（圖 2A、2B），籽粒厚度比對照高4.32%但差異不顯著（圖2C）；花后 15 d以后高溫處理小麥粒徑均小于對照，其中籽粒長度、寬度顯著小于對照，花后30d籽粒長度、寬度分別比對照高1.52%、2.96%。花后20、30 d時籽粒厚度與對照相比差異不顯著。

圖2 花后不同時期籽粒的長度、寬度和厚度Fig.2 The length，width and thickness of grain at different stages after anthesis

2.1.2 花后早期高溫對小麥籽粒粒重的影響

小麥籽粒發(fā)育過程中籽粒鮮、干重的動態(tài)變化見圖 3。

圖3 花后不同時期小麥籽粒的鮮重和干重變化Fig.3 .Changes of fresh weight and dry weight of wheat grains at different stages after anthesis

由圖3可知，隨著小麥籽粒的發(fā)育，花后早期高溫處理對籽粒鮮重有顯著影響?；ê笤缙诟邷靥幚砼c對照的鮮重最大值出現(xiàn)時期均在花后25 d，以后籽粒鮮重即迅速下降，而籽粒干重呈持續(xù)上升趨勢?；ê?0 d高溫處理小麥籽粒鮮、干重均顯著高于對照，分別比對照高6.71%、9.63%，而花后15 d后，籽粒的鮮、干重顯著低于對照。這表明早期高溫處理在小麥籽粒發(fā)育早期促進籽粒生長，顯著增加其鮮、干重，而在籽粒發(fā)育后期對籽粒充實造成影響，從而使得粒重顯著降低。

2.2 花后早期高溫對籽粒胚乳細胞發(fā)育的影響

2.2.1 花后早期高溫對籽粒胚乳細胞數(shù)量的影響

小麥籽粒發(fā)育過程中胚乳細胞數(shù)量的動態(tài)變化見圖4。由圖4可知，隨著小麥籽粒的發(fā)育，籽粒胚乳細胞數(shù)量呈先升高后降低的趨勢，高溫處理與對照胚乳細胞數(shù)量均在花后15 d達最大值?；ê?0-15 d，對照處理籽粒胚乳細胞數(shù)目顯著上升，增殖速率為10592個/日，此后胚乳細胞數(shù)目持續(xù)下降。與對照相比，高溫處理顯著增加籽?；ê?0 d胚乳細胞數(shù)目，此后顯著降低胚乳細胞數(shù)目，其花后10-15 d胚乳細胞增殖速率為2697.6個/日，亦明顯低于對照。上述結果表明，花后高溫脅迫在穎果發(fā)育早期促進胚乳細胞的分裂，增加胚乳細胞數(shù)量，進而促進胚乳的發(fā)育，但隨著發(fā)育進行，胚乳發(fā)育受到抑制。

圖4 花后不同時期小麥籽粒胚乳細胞數(shù)目的變化Fig.4 Changes of endosperm cell number in wheat grains at different stages after anthesis

2.2.2 花后早期高溫對胚乳細胞程序性死亡的影響

為觀察花后早期高溫脅迫下小麥籽粒胚乳PCD發(fā)生過程，本研究通過Evan's Blue染色法檢測小麥籽粒橫切面胚乳細胞的生活力（圖5），死細胞細胞膜通透性變差，Evan's Blue染色可將其染成藍色，而活細胞不著色。從圖5可以看出，高溫處理與對照在籽粒發(fā)育初期（10 d）胚乳細胞不著色，其著色部位主要集中在果皮?；ê?5 d開始檢測到胚乳著色，且隨著籽粒發(fā)育進程，著色逐漸加深，直到發(fā)育中后期（花后25-30 d）胚乳細胞被染成深藍色。高溫處理組，在花后10 d與對照組無明顯差異，花后15、20、25、30 d著色程度要明顯高于同時期對照處理組，說明高溫使胚乳細胞生活力大大下降。

圖5 花后不同時期胚乳細胞Evan's Blue染色Fig.5 Evan's Blue staining of endosperm cells at different stages after anthesis

2.3 花后高溫對小麥穎果發(fā)育的影響

2.3.1 對果皮發(fā)育的影響

花后早期高溫對果皮發(fā)育的影響主要表現(xiàn)為果皮細胞凋亡等的變化。由圖6可看出，花后10 d高溫處理的小麥穎果中果皮細胞層數(shù)為3層，而同時期對照中果皮層數(shù)為4層，且高溫處理小麥穎果中果皮細胞排列較對照更為緊密（圖6A、6B）。到花后15 d，高溫處理小麥穎果仍有一部分中果皮未凋亡，但中果皮層數(shù)少于花后10 d，而同期對照小麥穎果中果皮幾乎全部凋亡，且可以觀察到細胞凋亡留下的空腔（圖6C、6D）。此外，高溫處理穎果外果皮細胞壁的加厚程度要明顯高于對照。花后20-30 d只能觀察到加厚的外果皮，此外，在果皮發(fā)育過程中，果皮厚度不斷降低，而且高溫處理小麥果皮厚度在10 d前低于對照，此后兩者之間無明顯差異（圖6E-6G）。由此可看出，花后高溫在小麥穎果發(fā)育早期促進了果皮的發(fā)育，此后隨著穎果的發(fā)育，果皮的發(fā)育受到抑制，這表現(xiàn)在中果皮細胞凋亡的速度減緩。

圖6 花后不同時期小麥果皮發(fā)育圖Fig.6 Wheat peel development at different stages after anthesis

2.3.2 對胚發(fā)育的影響

圖7顯示了花后高溫處理前后小麥穎果胚的發(fā)育過程，因花后25 d以后的籽粒浸蠟困難，所切出的蠟帶中胚組織總是與蠟帶分離，無法進行切片研究。

圖7 花后不同時期小麥胚發(fā)育圖Fig.7 Wheat embryos development at different stages after anthesis

因此只獲得了花后10、15 d和20 d的小麥穎果胚發(fā)育的切片，采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計胚面積的變化。

由圖7可以看出，花后10 d高溫處理與對照小麥胚的大小無明顯差異，但胚周圍細胞排列更緊密，空隙更小，胚細胞分裂更為活躍（圖7A、7B）?；ê?5 d，胚分化出盾片、胚芽鞘和胚根鞘，花后高溫處理下小麥胚還分化出胚根，并且胚的大小要高于對照。這表明花后高溫促進了胚的發(fā)育，加速了胚發(fā)育分化的進程（圖7C、7D）。到花后20 d，胚進一步發(fā)育，繼續(xù)分化出胚芽和胚根，高溫處理小麥胚分化的更完全，但是胚的尺寸變小。

以上結果表明，花后早期高溫影響了小麥胚的發(fā)育進程，在發(fā)育前期，胚分化發(fā)育的進程加快，有利于胚的生長；發(fā)育中后期，胚的進一步發(fā)育受到抑制，這主要表現(xiàn)在胚體積擴大的抑制。

3 討論

3.1 花后早期高溫對小麥籽粒形態(tài)的影響

植株在經(jīng)過逆境脅迫后，其組織結構和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)通過主動或被動的調(diào)整來適應外界逆境[14]?；ê?-8 d高溫處理后，籽粒鮮重、干重的增長速率短時間內(nèi)大于常溫對照，但可能由于葉片光合產(chǎn)物供應能力的降低，表現(xiàn)為灌漿能力的衰退，平均灌漿速率下降對最終粒重造成顯著影響?；ê?5-25 d，籽粒胚乳細胞數(shù)已經(jīng)確定，以胚乳細胞充實為主[15]，此時高溫阻礙了籽粒中光合產(chǎn)物積累，縮短了胚乳細胞中物質(zhì)沉積期，表現(xiàn)為籽粒中胚乳細胞充實不良，籽粒重上升緩慢，最終降低了胚乳細胞中物質(zhì)沉積量，顯著地降低了最終粒重?；ê?5-30 d，籽粒已接近成熟，此時需要的灌漿物質(zhì)已不多，高溫可能對籽粒成熟過程起到阻礙作用，或者是縮短了物質(zhì)的有效轉(zhuǎn)運時間，致使光合產(chǎn)物積累量顯著下降，粒重顯著降低，最終在籽粒形態(tài)上表現(xiàn)為籽粒粒徑低于對照，且表面皺縮。

3.2 花后早期高溫對籽粒胚乳PCD的影響

花后5-8 d高溫短時間加速了胚乳細胞發(fā)育的進程，胚乳細胞數(shù)上升加快，但與此同時也加快了胚乳PCD進程，從而顯著減少最終胚乳細胞數(shù)。Evan's Blue染色可清楚觀察地觀察到小麥果皮、胚乳在發(fā)育過程中細胞死亡的發(fā)生過程。將死細胞染成藍色，而活細胞不著色。在花后15 d前是胚乳細胞快速增長積累時期，同時死亡的胚乳細胞數(shù)也迅速增加；花后20 d后，胚乳細胞數(shù)目有一定下降，胚乳大部分被染成藍色，而此時胚開始快速發(fā)育，種子中的營養(yǎng)積累開始轉(zhuǎn)向胚。胚乳是如何調(diào)節(jié)其一邊死亡一邊繼續(xù)積累淀粉的任務呢？目前對于此問題尚無定論，有研究認為部分mRNA可以選擇性表達，從而保持細胞質(zhì)中的代謝活動[16]。小麥胚乳中PCD的發(fā)生部位具有隨機性，這和水稻籽粒的觀察結果一致[17]，而玉米胚乳中PCD是從中上部開始[18]，說明物種間存在差異。

3.3 花后早期高溫對小麥穎果發(fā)育的影響

在小麥穎果發(fā)育過程中，果皮細胞很早就開始出現(xiàn)細胞程序性死亡（PCD）過程，果皮變薄，厚度不斷減小。Xiong等[19]根據(jù)外、中、內(nèi)果皮的整體發(fā)育階段以及中果皮中淀粉的動態(tài)積累，將果皮的發(fā)育分為生長期、形成期、消失期和成熟期4個時期。有研究[20-22]表明，環(huán)境因素在作物果皮的發(fā)育過程中具有重要的作用，比如CO2濃度、光照強度以及干旱脅迫均會影響果皮的發(fā)育。本研究結果表明，從花后15 d開始，果皮發(fā)育減緩，花后高溫處理后中果皮細胞層數(shù)高于對照水平。這可能由于小麥為應對早期的高溫逆境，加速生長進程，果皮凋亡提前，從而促進果皮發(fā)育，且高溫處理小麥穎果果皮細胞壁加厚，這可能是由于加厚的細胞壁能夠保水，減少水分蒸發(fā)，從而使小麥更好地應對高溫逆境造成的，而隨著發(fā)育的持續(xù)，果皮發(fā)育進一步受阻，果皮細胞凋亡速率減慢，從而抑制果皮發(fā)育。

小麥在受精后胚乳細胞經(jīng)過核分裂形成合胞體，一般認為花后4 d左右，胚乳游離核形成細胞壁，合胞體時期結束，細胞化時期開始。Begcy等[23]認為，胚乳合胞體時期向細胞化時期的過渡對穎果的發(fā)育十分重要，合胞體時期的持續(xù)以及細胞化的時間會影響籽粒的大小和重量。本研究中，遭花后高溫處理的小麥在花后10 d胚乳細胞數(shù)顯著多與常溫處理小麥胚乳。其原因可能是，花后高溫處理縮短了籽粒的發(fā)育時間，加速了發(fā)育過程，使得胚乳合胞體時期減短，細胞化提前，因此同一時期，花后高溫處理下小麥胚乳細胞數(shù)多。Wardlaw[24]研究也表明，在小麥開花后的前10 d，由于胚乳細胞分裂速率的增加，高溫脅迫下小麥穎果在早期具有較大的生長速率。此外本研究還發(fā)現(xiàn)花后高溫處理后，小麥胚分化更早，胚的面積在早期也高于對照，這些均表明花后高溫對胚發(fā)育的促進。Westgate等[25]也觀察到早期干旱和高溫共同脅迫下小麥擴大的胚和胚乳等類似組織學結果，并通過微陣列芯片分析了胚和胚乳中響應干旱和高溫的編碼儲藏蛋白基因、糖和淀粉代謝相關酶、組蛋白、熱激蛋白、蛋白酶、水孔蛋白以及一些轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控分子。然而在穎果發(fā)育中期，高溫對胚和胚乳的發(fā)育有著消極的影響，胚乳細胞數(shù)和胚的面積低于正常水平，形成一個更小但有功能的成熟胚。這可能是花后高溫減少穎果灌漿的持續(xù)時間，促進穎果早衰，限制細胞水分的吸收和干物質(zhì)的積累，從而阻礙了胚和胚乳體積的擴大，抑制穎果進一步生長[25]。發(fā)育后期，由于小麥變硬，花后25 d和30 d的籽粒石蠟切片很難制備，因此無法觀察籽粒發(fā)育后期胚的變化。

高溫是主要的非生物脅迫之一，影響作物的生理特性、基因表達和蛋白質(zhì)合成，進而影響作物的形態(tài)、花粉育性、籽粒灌漿，最終導致產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降。本研究從生理生化水平和細胞學水平研究小麥對高溫脅迫的響應，綜合分析花后早期高溫脅迫對小麥的影響，為進一步了解小麥耐熱性機制，及深入研究小麥響應逆境脅迫提供參考。