過表達IL-8受體對臍帶源間充質(zhì)干細胞生物活性的影響

王颯，王文強，李秋實，慕曉玲*

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002）

人臍帶源間充質(zhì)干細胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)由于其易獲取和免疫原性低備受研究者的關(guān)注，其在器官組織損傷后的修復(fù)和再生方面具有良好的臨床應(yīng)用前景[1]。然而如何保證移植入體內(nèi)的hUC-MSCs向受損組織定向遷移仍是其在臨床廣泛應(yīng)用的限制因素。因此對招募MSCs遷移歸巢到組織損傷部位的調(diào)控機制研究是促進其臨床成功應(yīng)用的重要一步。當(dāng)前認為MSCs從循環(huán)系統(tǒng)中向缺血缺氧性損傷、炎性反應(yīng)、機械損傷、燒傷等組織的遷移主要是損傷部位分泌的趨化因子的招募作用，趨化因子是在炎癥中激活的小分子蛋白，控制著細胞的招募[2]。白介素-8(interleukin-8，IL-8/CXCL8)是一種細胞因子，屬于CXC趨化因子家族。在炎性因子刺激下，多種細胞，包括內(nèi)皮細胞能夠分泌IL-8。IL-8對中性粒細胞?嗜堿性粒細胞和T細胞具有強大的趨化作用，與多種炎癥的發(fā)生有關(guān)。而中性粒細胞是機體反應(yīng)較早的防御?對抗組織損傷的白細胞，在損傷或感染組織釋放的趨化因子IL-8的誘導(dǎo)下，中性粒細胞遷移到損傷組織，IL-8能選擇性地與中性粒細胞膜表面的IL-8RA和IL-8RB結(jié)合，激活的IL-8受體通過誘導(dǎo)趨化因子調(diào)節(jié)子表達，觸發(fā)局部炎癥反應(yīng)[3-4]。

Ringe J等[5-6]第一次證實，表達IL-8受體的骨髓間充質(zhì)干細胞向損傷部位募集是由于炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的趨化因子，如 IL-8、IL-12、CCL 等[5-6]趨化所致。另外已有研究表明，靜脈輸注過表達IL-8受體(Interleukin-8 RA and/or RB receptors)的內(nèi)皮細胞治療實驗動物頸動脈內(nèi)皮損傷的效果引人注目。加載IL-8受體的內(nèi)皮細胞模擬了中性粒細胞的行為，與中性粒細胞競爭性地和過表達IL-8受體的損傷內(nèi)皮細胞結(jié)合，從而抑制了中性粒細胞引發(fā)的炎癥反應(yīng)，促進了內(nèi)皮的再生和血管修復(fù)[7]。然而IL-8RA/B過表達對MSCs的動員、遷移和募集等的影響研究還很少。

本研究以hUC-MSCs為研究對象，通過重組腺病毒轉(zhuǎn)染提高hUC-MSCs細胞膜上IL-8的特異性受體IL-8RA/B的表達，觀察其對MSCs細胞趨化、增殖、粘附能力的影響，以尋找進一步提高hUCMSCs歸巢能力的條件，從而提高hUC-MSCs移植的臨床治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

臍帶取自石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦，均經(jīng)產(chǎn)婦知情同意。pAd-IL-8RAGFP、pAd-IL-8RB-GFP和 pAd-Null-GFP腺病毒由美國阿拉巴馬大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系教授贈送；胎牛血清、DMEM /Low Glucose(Gibco公司)；胰蛋白酶(Solarbio)；IL-8 細胞因子 (Peprotech 公司)；cck-8 試劑盒(日本同仁)。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶源間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)的分離、培養(yǎng)

將無菌條件下取得的臍帶放入含有青霉素和鏈霉素的無菌平衡磷酸鹽溶液(PBS)中，4 h內(nèi)在細胞培養(yǎng)實驗室超凈臺中按照文獻[8]所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)的方法，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，洗去臍帶上殘留的血跡，將臍帶剪成2-3 cm的小段，每段均沿著靜脈腔剪開后剔除靜脈，再剔除2根動脈，取出華通氏膠部分，用剪刀反復(fù)剪成約1-2 mm3小塊，均勻接種于100 mm培養(yǎng)皿中，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4～5 d首次換液，以后每4天換液1次，待細胞長至80%～90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細胞。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(hUVECs)的分離、培養(yǎng)

取10 cm長的臍帶，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，洗去臍帶外側(cè)及靜脈腔內(nèi)的血跡，靜脈腔內(nèi)加入5 mL 1%的Ⅱ型膠原酶，止血鉗夾閉兩端，用鑷子輕輕揉搓臍帶，10 min后用含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化并沖臍靜脈，收集細胞懸液，離心后用ECM 培養(yǎng)基重懸，加入培養(yǎng)皿中，置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后換液，待細胞長至80%～90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細胞。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞表面標志物

取擴增傳代至第3代的臍帶源間充質(zhì)干細胞，棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液輕洗3遍，用0.25%胰蛋白酶消化，血清終止消化后用PBS緩沖液洗滌重懸，調(diào)整為細胞濃度為 1×106/mL的單細胞懸液，取0.5 mL/管，共5管，分別加入鼠抗人單克隆抗體FITC-CD29、FITC-CD44、FITC-CD34、FITC-HLA-DR各20 mL，充分混勻，避光，4℃冰箱孵育30 min，每管加入2 mLPBS緩沖液，流式細胞儀上機檢測。

1.2.4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs

將 P3代hUC-MSCs細胞按50%～60%接種于DMEM 培養(yǎng)基(含10%FBS)中，將重組腺病毒pAd-IL-8RA-GFP/pAd-IL-8RB-GFP和 pAd-Null-GFP按照MOI=10，30，100，300 感染 hUC-MSCs，48 h 后用熒光顯微鏡觀察 GFP表達情況以檢測感染率。

1.2.5 CCK-8試劑盒檢測腺病毒轉(zhuǎn)染對hUC-MSCs增殖能力的影響

hUC-MSCs在腺病毒感染48 h后，消化離心重懸，將細胞按照4×103/孔接種于96孔板中，只加培養(yǎng)基為空白對照組，每組設(shè)四個復(fù)孔，細胞貼壁后0、24、36、48、72 h 分別加入 10 μL 的 CCK-8 試劑，2 h后用全波長多功能酶標儀于 460 nm 波長處測量每孔的OD值，以細胞培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制增殖曲線。

1.2.6 Transwell實驗檢測IL-8RA/B對hUC-MSCs遷移能力的影響

按上述分組對各組 hUC-MSCs細胞感染病毒48 h后，調(diào)整細胞為 106個 /mL，接種至 Transwell小室中 (孔徑為 8 μm)，每上室加入100 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含有100 ng/ml IL-8細胞因子的培養(yǎng)基，于 37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h；取出Transwell小室后用棉簽擦拭膜上層細胞，PBS洗3遍后4%多聚甲醛固定15 min；1%的結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3遍，100倍鏡下觀察，隨機計數(shù)5個視野，計算染色細胞總數(shù)。

1.2.7 粘附實驗檢測IL-8RA/B過表達對hUC-MSCs向體外損傷內(nèi)皮粘附能力的影響

取P3代hUVECs種于24孔板中，待60%～70%密度時，加入10 ng/mL的TNF-α，培養(yǎng)箱中孵育16 h，分別加入感染48 h的hUC-MSCs細胞懸液100 μL，培養(yǎng)箱孵育30 min后，PBS緩沖液洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機選取3個視野，計數(shù)粘附細胞數(shù)目[9]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs和hUVECs的分離、傳代及鑒定

原代培養(yǎng)hUC-MSCs 5～7 d，倒置顯微鏡下可觀察到成纖維樣細胞從臍帶組織塊邊緣爬出，一般14～16 d細胞可達到80%～90%融合，連續(xù)傳代至P12代未見到細胞形態(tài)有明顯改變（圖1）。

圖1 hUC-MSCs的分離、傳代(100×)Fig.1 separation and passage of hUC-MSCs(100×)

經(jīng)流式細胞儀檢測，P3代hUC-MSCs細胞表達干細胞相關(guān)蛋白CD29、CD44，但不表達造血干細胞抗原CD34和白細胞相關(guān)抗原HLA-DR(圖2)。

圖2 流式細胞儀鑒定hUC-MSCsFig.2 Identification of hUC-MSCs by flow cytometry

原代培養(yǎng)hUVECs 4-5 d，細胞達到80%融合，鏡下可見細胞成短梭形排列。vWF是內(nèi)皮細胞特異性蛋白，免疫熒光顯示hUVECs表達vWF幾乎100%，結(jié)果如圖3所示。

圖3 vWF在hUVECs的表達Fig.3 expression of vWF in hUVECs

2.2 檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs的轉(zhuǎn)染效率

按照不同感染復(fù)數(shù)體外轉(zhuǎn)染hUC-MSCs 48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達，檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOI=100時，GFP的表達達到80%以上，并且細胞的狀態(tài)良好，因此后續(xù)實驗選擇此MOI值進行轉(zhuǎn)染（圖4）。

圖4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后GFP的表達(100×)Fig.4 expression of GFP on hUC-MSCafter transfection(100×)

2.3 過表達IL-8RA/B對hUC-MSCs增殖能力的影響

CCK-8增殖實驗測得轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染hUC-MSCs在 24、36、48、72 h的 OD 值，并作出增殖曲線，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與未轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs相比，過表達IL-8RA/B的hUC-MSCs的增殖能力并沒有明顯差異，P＞0.05（圖 5）。

圖5 腺病毒轉(zhuǎn)染對hUC-MSCs增殖能力的影響Fig.5 Effect of adenovirus transfection on proliferation of hUC-MSCs

2.4 IL-8RA/B過表達 對hUC-MSCs遷移能力的影響

在IL-8的趨化作用下，觀察到IL-8RA/B過表達組穿過小室的細胞數(shù)目明顯多于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒組，兩P值均＜0.01，而未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組并無明顯區(qū)別（圖6）。

2.5 IL-8RA/B過表達對hUC-MSCs向損傷內(nèi)皮粘附能力的影響(體外實驗)

由于TNF-α 對內(nèi)皮細胞造成損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞釋放IL-8因子，粘附實驗的結(jié)果顯示IL-8RA/B過表達組在損傷內(nèi)皮上粘附的細胞數(shù)目明顯多于空質(zhì)粒組，P＜0.01（圖 7）。

圖6 IL-8RA/B過表達對hUC-MSCs遷移能力的影響Fig.6 Effect of IL-8RA/B on hUC-MSCs cell migration

圖7 IL-8RA/B過表達對hUC-MSCs向損傷內(nèi)皮粘附能力的影響Fig.7 Effect of IL-8RA/B overexpression on adhesion ability to injured endothelial monolayers of hUC-MSCs

3 討論

血管內(nèi)皮是一個多功能的器官，它在維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細胞增殖以及血管生成、防止血栓的形成、介導(dǎo)炎癥與免疫反應(yīng)等方面有著非常重要的作用。血管內(nèi)皮損傷在冠心病、高血壓、糖尿病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的病理意義[9]。減輕內(nèi)皮損傷、促進內(nèi)皮的修復(fù)對于抑制內(nèi)膜增生有著關(guān)鍵的作用。MSCs是一類低免疫原性能夠在體外誘導(dǎo)分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等的多能干細胞，可從骨髓、臍帶竇血、臍帶膠樣組織、胎盤、脂肪組織及肺組織等組織中分離，其作為組織工程修復(fù)的種子細胞受到越來越多的關(guān)注[10]。有研究表明，循環(huán)中以及周圍組織中的MSCs在各種趨化因子及粘附分子的作用下，可以向損傷部位遷移發(fā)揮其修復(fù)作用，但是在機體受損的情況下，MSCs很難被動員起來[11-12]。Kim等研究者借助生物材料將MSCs覆蓋在兔子模型頸動脈球囊損傷的血管部位，發(fā)現(xiàn)MSCs能夠減輕損傷血管的內(nèi)膜增生情況[13]。因此，移植的MSCs如何能夠有效到達損傷部位仍是制約其細胞治療效果的關(guān)鍵。

Rombouts等[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過傳代培養(yǎng)的MSCs的歸巢能力明顯低于原代細胞，這可能是由于經(jīng)過傳代培養(yǎng)后MSCs表面某些受體的表達減少。近年來，關(guān)于SDF-1/CXCR4在MSCs中作用的研究非常多，CXCR4能夠促進MSCs在體外向SDF-1遷移[15]，已經(jīng)證明CXCR4過表達的MSCs能夠促進急性肝損傷的肝再生[16]。因此，通過基因和細胞結(jié)合治療疾病已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的熱點。在本研究中，我們給hUC-MSCs加載IL-8RA/B，探討其在體外向IL-8和損傷內(nèi)皮遷移的能力。

IL-8RA/B是趨化因子IL-8的特異性受體，IL-8作為趨化因子家族的一員在很多炎癥疾病中扮演著重要角色[17]，特別是在損傷部位，IL-8分泌增多，并且能夠招募中性粒細胞，促進中性粒細胞向損傷和炎癥反應(yīng)部位粘附、募集，這主要是由于它和中性粒細胞表面的IL-8RA/B相互作用[17]。劉等人研究了SDF-1、IL-8、bFGF3種細胞因子在體外對骨髓間充質(zhì)干細胞的趨化作用，結(jié)果顯示在100 ng/mL時，SDF-1和IL-8的趨化作用優(yōu)于bFGF，并且二者的作用峰值和趨化的細胞數(shù)目都比較接近[18]。參照IL-8的濃度，在本研究的Transwell實驗中，我們在下室加入100 ng/mL的IL-8因子，結(jié)果表明IL-8能夠明顯促進hUC-MSCs向下室遷移，并且過表達IL-8RA/B的hUC-MSCs遷移的細胞數(shù)目明顯多于未轉(zhuǎn)染組。Takashi等人在研究IL-8體外促進終末內(nèi)皮細胞(OEC)的成血管能力時，對OEC向IL-8趨化性也做了研究，OEC表達IL-8RA/B，它能夠向IL-8趨化[19]，這和我們的實驗結(jié)果是一致的。

另外，本研究中我們觀察到過表達IL-8RA/B的hUC-MSCs粘附在TNF-α處理過的內(nèi)皮細的數(shù)目更多，也有力地說明了IL-8/IL-8RA/B促進了MSCs的歸巢。在血管損傷中，受損的內(nèi)皮釋放IL-8，使中性粒細胞向損傷部位遷移，進一步加強炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致內(nèi)膜增生[20]。我們推測加載了IL-8RA/B的MSCs可能和中性粒細胞競爭性向損傷內(nèi)皮粘附，從而減輕炎癥反應(yīng)。

Xing等[7]研究者建立大鼠頸動脈損傷模型，通過股靜脈向大鼠輸注過表達IL-8RA/B且表達GFP的大鼠動脈內(nèi)皮細胞，觀察到24 h在損傷部位粘附的過表達組細胞數(shù)目明顯高于空質(zhì)粒組，28 d血管內(nèi)膜增生的情況在過表達組得到了很大改善。本研究采用hUC-MSCs，通過腺病毒轉(zhuǎn)染使其過表達IL-8RA/B，通過一系列體外實驗證實了IL-8受體在hUC-MSCs中表達，并且IL-8受體的過表達增強了其向IL-8因子趨化的能力，這與EC細胞作為研究對象的實驗結(jié)果是一致的。鑒于MSCs具有ECs所沒有的多向分化潛能，以及可以分泌多種因子促進損傷修復(fù)的作用，我們推測過表達IL-8受體的hUC-MSCs比內(nèi)皮細胞修復(fù)血管內(nèi)皮損傷具有更好的效果，這還有待進一步探究。