蛇床子素對模擬微重力引起的骨質(zhì)流失的防治作用

馮秀 何進(jìn)鵬 華君瑞 李賀,3 石文貴,3 龍凱琴 王菊芳*

1. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省空間輻射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

在航天活動中，微重力導(dǎo)致的廢用性骨質(zhì)流失對宇航員的身體健康造成極大的威脅，成為人類長期滯留太空或進(jìn)行宇宙探索的主要障礙之一。在眾多系統(tǒng)中，骨骼系統(tǒng)是保障人正常運(yùn)動和形態(tài)的重要系統(tǒng)。在地球上，人類的骨骼系統(tǒng)已完全適應(yīng)地心引力1 g(G-force)作用的環(huán)境。當(dāng)航天器在引力場中飛行時(shí)，受到的引力約10-6～10-4g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于地球上正常的引力，使骨代謝功能紊亂，骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)受到損害。研究報(bào)道，當(dāng)宇航員在太空飛行半年左右，微重力導(dǎo)致骨礦物質(zhì)的持續(xù)丟失，骨密度減少約1%，相當(dāng)于絕經(jīng)后婦女1年的減少量[1]。尾吊大鼠是地基模擬微重力較好的動物模型，且已得到NASA的認(rèn)可[2]。目前針對微重力導(dǎo)致的骨質(zhì)流失采取的各種對抗措施，除常規(guī)鍛煉和鈣劑補(bǔ)充外，化學(xué)藥和生物制品或多或少出現(xiàn)不良反應(yīng)，如雙膦酸鹽導(dǎo)致胃腸道紊亂，甲狀旁腺素導(dǎo)致頭痛，腿抖等，而中藥治療臨床骨質(zhì)疏松有較好療效且不良作用少，因此我們探索傳統(tǒng)中藥是否有較好效果。

蛇床子素(Osthole)，又名7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是一種從傘形科植物蛇床子Cnidiummonnieri(L)Cusson成熟果實(shí)提取的天然化合物。近年研究表明，蛇床子素具有抗心律失常、抗炎、抗癌及抗骨質(zhì)疏松等多方面的藥理作用[3-5]，尤其在治療骨質(zhì)疏松方面具有較大的潛力。蛇床子素不僅能夠提高OPG敲除小鼠的骨量和骨小梁參數(shù)，還對去卵巢大鼠導(dǎo)致的骨質(zhì)流失有良好的療效[6]。本實(shí)驗(yàn)以尾吊大鼠模擬微重力誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失，研究蛇床子素對模擬微重力引發(fā)的骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝血清指標(biāo)，骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響，為將其應(yīng)用于防治空間環(huán)境下骨質(zhì)流失提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用2月齡健康Wistar 雌性大鼠24只，體質(zhì)量約200 g，清潔級，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠在溫度(23±2)℃，相對濕度50%～60%，光照12 h循環(huán)的動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑

蛇床子素(寶雞市辰光生物科技有限公司, 貨號：HO098365)，純度>98%；血清骨特異性堿性磷酸酶(BALP，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml003415)；骨鈣素(OCN，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml002883)；抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml003177)；TRIzol(Life Technologies, 貨號：15596-026)；All-in-OneTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州復(fù)能基因有限公司，貨號：AORT-0020)；骨保護(hù)素(OPG，廣州復(fù)能基因有限公司，貨號：RQP049193)；核因子-κB受體激活劑配體(RANKL，廣州復(fù)能基因有限公司，貨號：RQP052161)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，廣州復(fù)能基因有限公司，貨號：RQP049573)。

1.3 動物造模及分組

健康大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，稱重后隨機(jī)分為3組，即對照組(Ctrl)、尾吊組(HLS)、尾吊給藥組(OST)。采用Morey-Holton方法[2]將尾吊組及尾吊給藥組大鼠尾部懸掛于籠子橫梁，使軀干與地面成30°角，身體可360°水平旋轉(zhuǎn)，前肢自由活動。

1.4 給藥過程及取材

每天上午采用灌胃的方式給藥，尾吊給藥組按10 mg/(kg·d)劑量給予蛇床子素，對照組及尾吊組給予同體積生理鹽水。飼養(yǎng)4周，末次給藥次日上午稱重后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，進(jìn)行腹主動脈取全血，分離血清；分離肝臟、腎臟、脾臟稱重并記錄；分離后肢股骨和脛骨，剔凈周圍肌肉結(jié)締組織。血清分裝成20 μL每份，-70 ℃保存，用于ELISA分析；大鼠左側(cè)股骨用浸有生理鹽水的紗布包裹，放于-20 ℃保存，用于測骨密度(BMD)及生物力學(xué)；右側(cè)股骨用體積分?jǐn)?shù)為0.75乙醇保存，進(jìn)行microCT分析；左側(cè)脛骨近心端進(jìn)行梯度脫水后包埋、組織切片以及Van Gieson(VG)染色處理；取大鼠右側(cè)脛骨近心端保存于液氮中，用于qRT-PCR分析。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1臟器指數(shù)分析：將分離的脾臟、肝臟和腎臟，用濾紙吸干殘留的血液后，稱重(g)，然后分別除以母體的體重(g)，再乘以100%，即得相應(yīng)的脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)。

1.5.2骨密度及骨生物力學(xué)檢測：將用紗布包裹的左側(cè)股骨室溫化凍后，用美國GE公司雙能X線骨密度儀(DXA)進(jìn)行掃描。掃描結(jié)果用DXA自帶的enCORE軟件進(jìn)行分析。將測完骨密度的股骨用島津AG-IS10KN型拉伸試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，加壓點(diǎn)為中心，加載速度為10 mm/min， 支點(diǎn)跨距為1.5 cm。用儀器自帶的函數(shù)記錄分析軟件得出最大載荷值及彈性模量。

1.5.3血清骨代謝指標(biāo)測定：將各組血清于常溫化凍后，按照ELISA試劑盒說明書在酶標(biāo)儀上450 nm波長處，檢測血清中BALP、OCN、TRACP-5b水平。

1.5.4脛骨形態(tài)學(xué)觀察：取大鼠脛骨上端約1 cm，經(jīng)酒精梯度脫水、甲基丙烯酸甲酯包埋，不脫鈣切片后，進(jìn)行Van Gieson 染色。用Olympus顯微鏡觀察大鼠脛骨組織切片形態(tài)特征，并進(jìn)行圖片采集。

1.5.5MicroCT分析：在距離股骨遠(yuǎn)端骨骺線2 mm處，用Skyscan 1176高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描儀(microCT)進(jìn)行掃描。三維掃描圖像用自帶軟件進(jìn)行分析，同時(shí)比較以下骨小梁參數(shù)：骨密度(g/cm3)，骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV, %)，骨小梁分離度(Tb.Sp, mm)， 骨小梁厚度(Tb.Th, mm)，骨小梁數(shù)量(Tb.N, n/mm)。

1.5.6脛骨OPG和RANKL的mRNA表達(dá)：將脛骨近端加液氮研磨至細(xì)粉狀，用TRIzol 法提取總RNA，并用分光光度計(jì)測260 nm和280 nm的吸光值(OD值)，用OD260/OD280測定RNA純度，比值在2左右表示所提取RNA為純品。按照All-in-OneTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和基于SYBR Green的實(shí)時(shí)定量PCR分析。實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)收集由BIO-RAD CFX96 PCR系統(tǒng)(美國)自帶的軟件完成，收集所有樣品的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行校準(zhǔn)，采用2-ΔΔCt方法對目標(biāo)基因OPG、RANKL mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重及脾臟、肝臟和腎臟指數(shù)

由表1可見，各組大鼠體重均無顯著變化，但是尾吊會使大鼠體重增長緩慢。脾臟、肝臟、腎臟指數(shù)在尾吊組有上升趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尾吊時(shí)給予蛇床子素后，脾臟、肝臟和腎臟指數(shù)與正常組接近。

表1 大鼠體重、脾臟、肝臟和腎臟指數(shù)變化情況Table 1 The changes of body weight and indexes of spleen, liver, and kidney n=8)

2.2 骨密度及骨生物力學(xué)指標(biāo)

離體股骨骨密度檢測結(jié)果如表2所示，與對照組相比，大鼠尾吊4周后，股骨骨密度，最大載荷值和彈性模量顯著降低(P<0.05)；給予蛇床子素后，股骨骨密度和最大載荷值顯著上升(P<0.05)，一定程度上增大了股骨的彈性模量。表明蛇床子素通過增強(qiáng)骨密度和生物力學(xué)來增強(qiáng)尾吊大鼠的骨強(qiáng)度。

2.3 血清生化指標(biāo)

由表3可見，尾吊4周后，血清中BALP和OCN較對照組均顯著下降(P<0.05)，而TRACP-5b濃度顯著上升(P<0.05)；尾吊時(shí)給予蛇床子素，可緩解尾吊導(dǎo)致的BALP和OCN的降低，甚至BALP可恢復(fù)近正常，而TRACP-5b顯著降低(P<0.01)。

GroupsBMD (g/cm2)Maximun load (N)Elasticity modulus(N/mm2)Ctrl0.120±0.002117.98±4.7812752.63±971.34HLS0.104±0.001??94.19±2.16?10247.00±99.43?OST0.114±0.005#113.78±7.80#11108.30±581.67

注：與Ctrl比較，*P<0.05，**P<0.01；與HLS比較，#P<0.05。

表明蛇床子素可促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌，增加血清中BALP和OCN的含量并抑制破骨細(xì)胞分泌，減少血清中TRACP-5b的含量雙向抑制尾吊大鼠導(dǎo)致的骨質(zhì)流失。

GroupsBALP(μg/L)OCN(ng/L)TRACP-5b(ng/mL)Ctrl30.91±2.11525.88±21.0713.98±0.42HLS23.64±1.40?442.24±15.97?15.07±0.32?OST28.72±1.96#481.41±21.9913.75±0.14##

注：與Ctrl比較，*P<0.05；與HLS比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 MicroCT及脛骨形態(tài)分析

股骨遠(yuǎn)端經(jīng)microCT 掃描后，由表4及圖1可見，尾吊組BMD、BV/TV和Tb.Th均比對照組顯著降低(P<0.01)，尾吊給藥組扭轉(zhuǎn)尾吊對骨小梁造成的損壞，表現(xiàn)在顯著提高了骨密度，骨小梁體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度(P<0.01)。同時(shí)，尾吊組骨小梁分離度顯著增大(P<0.01)，給予蛇床子素后，這種現(xiàn)象得到很大改善。然而，在骨小梁數(shù)量方面，盡管尾吊組和對照組沒有顯著變化，但尾吊給藥后骨小梁數(shù)量明顯增多。如圖2所示，大鼠脛骨近端VG染色切片在光鏡下觀察，也觀察到與micro CT結(jié)果一致的現(xiàn)象。對照組骨小梁縱橫交錯，呈網(wǎng)狀分布，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓腔狹小。尾吊組骨小梁間隙增大，數(shù)量減少，呈明顯的“蜂窩狀”，甚至有些骨小梁消失不見；與尾吊組相比，OST組骨小梁密集程度明顯升高，數(shù)量也明顯增多。表明蛇床子素可以改善骨小梁微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)尾吊大鼠骨密度和骨強(qiáng)度。

表4 脛骨骨小梁參數(shù)的變化Table 4 The changes of trabecular bone parameters in the tibia n=8)

注：與Ctrl比較，**P<0.01；與HLS比較，#P<0.05,##P<0.01。

圖1 各組骨小梁3D重建圖Fig.1 The 3-dimensional reconstructions of trabecular bone in each groupA: Ctrl; B: HLS; C: OST

圖2 各組脛骨骨小梁形態(tài)變化(VG 染色，×40)Fig.2 The morphological changes of trabecular bone in tibia in each group (VG stain, ×40)A: Ctrl; B: HLS; C: OST

2.5 脛骨OPG和RANKL mRNA表達(dá)水平

骨質(zhì)流失的本質(zhì)是成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收的不平衡。破骨細(xì)胞骨吸收主要由關(guān)鍵的破骨細(xì)胞因子RANKL促進(jìn)，當(dāng)其誘餌受體OPG與RANKL結(jié)合，可緩解骨吸收[7]。由圖3可見，尾吊組脛骨中OPG mRNA表達(dá)下調(diào)，RANKL mRNA表達(dá)上調(diào)，且OPG/RANKL比值顯著降低(P<0.05)，表明脛骨內(nèi)破骨吸收處于優(yōu)勢地位。尾吊時(shí)給予蛇床子素后，OPG/RANKL比值發(fā)生反轉(zhuǎn)，且具有顯著意義。表明蛇床子素可通過抑制尾吊大鼠破骨基因表達(dá)，從基因表達(dá)層面抑制模擬微重力導(dǎo)致的骨質(zhì)流失。

圖3 各組脛骨OPG和RANKL mRNA 表達(dá)及OPG/RANKL比值變化(A: Ctrl; B: HLS; C: OST)注：與Ctrl比較，*P<0.05；與HLS比較，#P<0.05。Fig.3 The changes of OPG, RANKL mRNA expression level and the ratio of OPG/RANKL in tibia in each group(A: Ctrl; B: HLS; C: OST)Note: vs Ctrl,*P<0.05; vs HLS,#P<0.05。

3 討論

近年來我國航空事業(yè)迅速發(fā)展，而太空飛行導(dǎo)致的廢用性骨質(zhì)流失卻嚴(yán)重影響了宇航員的身體健康，阻礙了宇航事業(yè)的發(fā)展，因此解決微重力誘發(fā)的骨質(zhì)流失勢在必行。尾吊大鼠模擬的骨質(zhì)流失與宇航員太空飛行時(shí)發(fā)生的骨質(zhì)流失情況極為相似，均是體液頭向分布，骨質(zhì)流失主要發(fā)生在后肢承重骨，故尾吊大鼠是地面模擬微重力誘導(dǎo)骨質(zhì)流失較好的動物模型[8-9]。在臨床上，骨質(zhì)流失常表現(xiàn)出不耐久坐、骨痛等癥狀，在中醫(yī)學(xué)辯證上可將骨質(zhì)流失歸屬為骨痹、腎痹、骨枯、骨萎等?！夺t(yī)經(jīng)精義》：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者，腎之合也，髓者，精之所生也，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強(qiáng)”，即中醫(yī)強(qiáng)調(diào)腎為先天之本，精氣貯藏之所；而精氣者乃性命之根，髓、骨生化之源，故腎精足則髓足而骨強(qiáng)，由此腎精虛弱與骨質(zhì)流失密切相關(guān)；而中醫(yī)學(xué)對骨質(zhì)流失的治療多以補(bǔ)腎壯骨、祛寒益精為主[10-11]。中藥蛇床子性溫，味辛、苦，主歸腎經(jīng)，脾經(jīng)，具有溫腎壯陽、祛風(fēng)燥濕、殺蟲止癢等功效，常用于治療腎虛陽痿、寒痹腰痛、濕疹陰癢等疾病，故在臨床上常將蛇床子配伍于治療腎虛陽痿、骨痹腰痛等經(jīng)方中[12]。蛇床子素為蛇床子的主要活性物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)蛇床子素防治骨質(zhì)疏松有較好的效果[13]，而蛇床子素對模擬太空微重力導(dǎo)致的骨質(zhì)流失是否具有防治作用尚無系統(tǒng)的研究，故本次實(shí)驗(yàn)通過尾吊模型模擬太空微重力導(dǎo)致的骨質(zhì)流失，并用蛇床子素進(jìn)行干預(yù)，用以探索蛇床子素對太空微重力導(dǎo)致的骨質(zhì)流失的影響。

本次實(shí)驗(yàn)從DXA在二維檢測了股骨骨密度，并選擇了microCT從三維角度分析了股骨骨密度及骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步形象闡釋了大鼠發(fā)生骨質(zhì)流失時(shí)骨小梁數(shù)量變少，間隙變大，導(dǎo)致骨密度降低，脆性增強(qiáng)的現(xiàn)象。與此同時(shí)，VG染色與microCT 3D重建圖像相輔相成，在視覺上展示了尾吊誘發(fā)骨質(zhì)流失及蛇床子素治療具有良好的防護(hù)效果。除此之外，我們選擇BALP、OCN和TRACP-5b分別作為血清中骨形成和骨吸收指標(biāo)。BALP由成骨細(xì)胞分泌，是總堿性磷酸酶的重要部分，當(dāng)肝功能正常時(shí)，肝臟和骨骼來源的堿性磷酸酶各占血液總堿性磷酸酶的一半。骨源性堿性磷酸酶與總堿性磷酸酶呈正相關(guān)，可部分反映骨形成狀態(tài)。OCN是骨基質(zhì)中含量最豐富和骨形成過程產(chǎn)生較晚的標(biāo)志物。TRACP-5b是由細(xì)胞分泌的非膠原蛋白，是反映破骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物，且血清TRACP-5b與骨吸收水平呈正相關(guān)[14]。我們發(fā)現(xiàn)尾吊大鼠血清中BALP顯著降低，TRACP-5b顯著升高，這與Fahmy等[15]研究大鼠切除卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松結(jié)果相符，提示尾吊大鼠會誘發(fā)骨質(zhì)流失。尾吊時(shí)給予蛇床子素可扭轉(zhuǎn)尾吊誘發(fā)的骨代謝指標(biāo)的變化。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和抗骨吸收作用的重要途徑之一，而OPG和RANKL主要由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌，調(diào)控二者的表達(dá)水平?jīng)Q定了對破骨細(xì)胞的調(diào)控方向[16]。在脛骨OPG和RANKL mRNA 表達(dá)水平分析過程中，我們發(fā)現(xiàn)尾吊大鼠脛骨內(nèi)OPG mRNA表達(dá)下調(diào)，RANKL mRNA表達(dá)上調(diào)，這可能是由于尾吊刺激成骨細(xì)胞過度表達(dá)RANKL而降低OPG表達(dá)，使RANKL與RANK結(jié)合，啟動破骨細(xì)胞的分化和功能活性，骨吸收過程活躍，這一現(xiàn)象與Li等[17]的結(jié)果一致。尾吊組大鼠聯(lián)合蛇床子素處理后扭轉(zhuǎn)了脛骨內(nèi)OPG和RANKL的表達(dá)，使OPG/RANKL比值較單獨(dú)尾吊組顯著增加。另外，我們發(fā)現(xiàn)尾吊組大鼠較正常組大鼠脾臟、肝臟和腎臟均出現(xiàn)輕微腫大現(xiàn)象，尾吊時(shí)給予蛇床子素后可以緩解這一現(xiàn)象，可能與《本草經(jīng)疏》中“蛇床子苦能除濕,溫能散寒,辛能潤腎,甘能益脾”的藥理作用有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

總而言之，蛇床子素可通過抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成來達(dá)到預(yù)防模擬微重力誘發(fā)的骨質(zhì)流失。這表明了在預(yù)防宇航員骨量減少方面的新的潛在可行策略。