蒜頭果中植物內(nèi)生真菌煙曲霉的抗菌活性研究*

李娟,陳中華,華梅,原曉龍,虞泓,王毅

(1.云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650091;2.國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650201;3.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明650201)

植物內(nèi)生真菌是一類(lèi)在宿主植物的健康組織內(nèi)完成整個(gè)或部分生活周期,但不引起寄主植物產(chǎn)生明顯疾病癥狀的真菌[1]。幾乎所有植物體內(nèi)均有內(nèi)生真菌的存在[2]。在健康植株中,內(nèi)生真菌和其寄主植物通常是互惠共生的。植物為內(nèi)生真菌提供營(yíng)養(yǎng)和舒適的環(huán)境,有些內(nèi)生真菌能促進(jìn)寄主植物的生長(zhǎng)并提高植物對(duì)生物逆境和非生物逆境的耐受性[3-4]。草本植物中的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生具有毒性的生物堿,從而保護(hù)寄主不被食草動(dòng)物取食[5]。香柱菌屬 (Epichloe)一內(nèi)生真菌新種 (Epichloe gansuensis),可以抑制醉馬草 (Achnatherum inebrians)上禾本科布氏白粉菌 (Blumeria graminis)的定殖[6]。牧草內(nèi)生菌產(chǎn)生的毒麥堿對(duì)鄰近植物有較強(qiáng)的化感作用。面對(duì)非生物脅迫,植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物,提高寄主對(duì)干旱、高溫、高鹽、重金屬等脅迫的耐受性。由于植物內(nèi)生真菌生存環(huán)境的多樣性以及種類(lèi)的多樣性,決定了植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的多樣性。研究表明,從植物中分離得到的內(nèi)生真菌可產(chǎn)生多種活性物質(zhì),多具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲(chóng)、免疫抑制、抗氧化和降糖等活性,其中有一些是具有特殊活性的新物質(zhì)[7]。如短葉紫杉 (Taxus brevifolia)的樹(shù)皮中分離出產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌 (Taxomyces andreanae)能產(chǎn)生抗乳腺癌、子宮癌、卵巢癌的化合物紫杉醇 (taxol)[8]。從蛇足石杉 (Huperzia serrata)的內(nèi)生菌 (Penicillium chrysogenum P1X)中分離得到9種具有較罕見(jiàn)C25類(lèi)固醇骨架的抗菌甾體類(lèi)化合物[9]。

目前臨床上抗生素的大量使用,使許多致病細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng),根據(jù)2012年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性檢測(cè)報(bào)道,耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌 (MRCNS)的檢出率平均為77.1%;大腸埃希菌 (Escherichia coli)對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素和哌拉西林的耐藥率均接近或高于50.0%[10]。耐藥菌感染已嚴(yán)重危害人類(lèi)健康,尋找新的抗菌藥物來(lái)代替抗生素已迫在眉睫。植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)多數(shù)是新化合物,因此,有望從中尋找到新的抗生素。例如,從紅樹(shù)林植物鹵蕨 (Acrostichum aureurm)中分離得到的內(nèi)生真菌 (Penicillium sp.0935030)能產(chǎn)生兩種抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)的環(huán)肽化合物[11]。從雞冠刺桐(Erythrina crista-galli)的內(nèi)生真菌 (Phomopsis sp.)發(fā)酵液中獲得的一個(gè)新抗生素Phomol對(duì)24種細(xì)菌和真菌都顯示出很好的抗菌活性[12]。

目前,雖然已從其他植物中分離獲得具有許多生物活性的內(nèi)生真菌,但對(duì)云南珍稀瀕危植物蒜頭果 (Malania oleifera)內(nèi)生真菌的活性研究還未見(jiàn)報(bào)道。單菌多產(chǎn)物 (OMSAC)策略主要是通過(guò)改變培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法等手段,激活微生物中沉默基因,以產(chǎn)生大量具有活性的代謝產(chǎn)物,為新型藥物的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物[13]。因此,本研究從我國(guó)特有的單屬種植物,鐵青樹(shù)科 (Olacaceae)蒜頭果屬 (Malania)的蒜頭果中分離獲得植物內(nèi)生真菌,使用OMSAC策略進(jìn)行發(fā)酵,并檢測(cè)其發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性,以期為蒜頭果內(nèi)生真菌的統(tǒng)合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙曲霉菌種 (Aspergillus fumigatus)從蒜頭果植株中分離獲得,經(jīng)ITS及形態(tài)鑒定后,保存在云南省林業(yè)科學(xué)院,國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物繁育和保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,菌株編號(hào)為MOEF013。供試6種人體致病細(xì)菌分別為蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)、副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)、無(wú)乳鏈球菌 (Streptcococcus agalactiae)、福氏志賀氏菌 (Shigella flexneri)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌 (Micrococcus luteus)。由昆明市食品藥品檢驗(yàn)所贈(zèng)送。

1.2 不同液體培養(yǎng)基的配制

OMAM培養(yǎng)基 蔗糖 (20g/L)與葡萄糖(20g/L)為碳源,酵母粉 (1g/L)和大豆蛋白胨(20g/L)為氮源。

不同氮源的培養(yǎng)基 麥芽糖 (1.8g/L)與葡萄糖 (6g/L)為碳源,編號(hào)為M與G,分別以4g/L的麥芽浸粉 (M1)、酵母粉 (Y2)、番茄浸粉(T)、馬鈴薯浸粉 (P)、大豆蛋白胨 (S)、胰蛋白胨 (Y1)、牛肉浸粉 (B)、酪蛋白胨 (L)和香蕉粉 (B1)為氮源,配制成碳源相同氮源不同的液體培養(yǎng)基,編號(hào)分別為 MGM1、MGY2、MGT、MGP、 MGS、 MGY1、 MGB、 MGL、 MGB1。

不同碳源的培養(yǎng)基 麥芽浸粉 (6g/L)與酵母粉 (3g/L)為氮源,分別以4g/L的甘露醇、麥芽糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、肌醇、果糖、可溶性淀粉為碳源,配制成氮源相同碳源不同的液體培養(yǎng)基,編號(hào)分別為man、mal、sor、suc、luc、 glu、 ino、 fru、 sta。

1.3 OSMAC策略尋找最佳培養(yǎng)條件

不同條件下分別培養(yǎng)MOEF013,對(duì)其不同的提取物做活性檢測(cè),具體為無(wú)菌條件下,研碎煙曲霉菌體;不同接種量為研碎15mg、30mg、60mg、90mg、120mg菌體各一份,在OMAM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);不同培養(yǎng)條件為接種到OMAM培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)5d后,分別加入細(xì)菌共培養(yǎng)、周期性改變培養(yǎng)溫度 (15℃與28℃交替改變,每12h改變一次)、共培養(yǎng)的同時(shí)改變培養(yǎng)溫度3種條件下再培養(yǎng)5d;不同培養(yǎng)基分別接種到不同碳源和不同氮源的液體培養(yǎng)基中,28℃,150r/min搖床培養(yǎng)10d。

收獲培養(yǎng)物完全干燥后加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)制備成50mg/mL提取物的DMSO溶液,備用。

1.4 提取物抗菌活性檢測(cè)

致病細(xì)菌懸浮液的制備 分別接種6種檢測(cè)細(xì)菌于LB固體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)12h后,挑取單菌落接種到5mL液體LB培養(yǎng)基中,搖床37℃,180r/min培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到1×106-6×106cfu/mL,備用。

抑菌實(shí)驗(yàn)采用紙片法 將各檢測(cè)菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上,略干后將加有10μL提取物的濾紙片 (φ=5mm)放置在含有檢測(cè)菌的培養(yǎng)基上,10μL DMSO作為陰性對(duì)照,37℃恒溫培養(yǎng)24h后測(cè)量抑菌圈大小。每個(gè)菌種重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

測(cè)定最小抑菌活性 (MIC) 采用二倍稀釋法,測(cè)定具有活性提取物的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度

檢測(cè)MOEF013提取物對(duì)6種人體致病菌的抗菌活性,結(jié)果顯示,提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、無(wú)乳鏈球菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌具有良好的抗菌活性。二倍稀釋法測(cè)定MOEF013發(fā)酵提取物對(duì)6種致病菌的MIC(表1),提取物對(duì)副溶血性弧菌和藤黃微球菌抑菌效果較好,最低抑菌濃度為6.25mg/mL,金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、福氏志賀氏菌最低抑菌濃度為12.5mg/mL。蠟樣芽孢桿菌的MIC值為25.0mg/mL,說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌對(duì)煙曲霉提取物敏感性較低。

表1 MOEF013提取物對(duì)6種致病菌的MICTab.1 The minimum inhibitory concentration of MOEF013 extracts to 6 kinds of pathogenic bacteria

圖1 MOEF013提取物對(duì)藤黃微球菌的MICFig.1 MIC of MOEF013 extracts to Micrococcus luteus

2.2 接種量對(duì)煙曲霉抑菌活性的影響

按照不同接種量培養(yǎng)MOEF013菌株10d后收獲其代謝產(chǎn)物,乙酸乙酯提取后測(cè)定抑菌活性。結(jié)果顯示,不同接種量對(duì)抑菌活性沒(méi)有影響,但對(duì)產(chǎn)物的提取量有明顯影響 (圖2)。

圖2 接種量對(duì)MOEF013次生代謝產(chǎn)物提取量的影響Fig.2 Influence of inoculation quantity on the extraction of secondary metabolites from MOEF013

由圖2可以看出,隨著接種量的增加,提取量逐漸增加,當(dāng)接種量為60mg時(shí),提取量最高,接種量大于60mg時(shí),提取量逐漸下降。

2.3 共培養(yǎng)和培養(yǎng)溫度變化對(duì)MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性的影響

通過(guò)周期性改變培養(yǎng)溫度、與細(xì)菌共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)煙曲霉提取物抑菌活性有所變化 (表2)。相比對(duì)照組,溫度變化后煙曲霉提取物除對(duì)無(wú)乳鏈球菌抗菌效果不變,對(duì)藤黃微球菌抗菌效果略微下降外,對(duì)其余4種致病菌的抗菌活性都有所增強(qiáng)。加入細(xì)菌共培養(yǎng)后對(duì)蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的抗菌活性有所增強(qiáng),但對(duì)副溶血性弧菌、無(wú)乳鏈球菌、福氏志賀氏菌的抗菌活性下降。共培養(yǎng)并改變溫度后對(duì)蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、福氏志賀氏菌3種致病菌的抗菌效果有所增強(qiáng),但對(duì)無(wú)乳鏈球菌、藤黃微球菌的抗菌效果減弱,對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有影響。

表2 共培養(yǎng)和溫度變化對(duì)MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性影響Tab.2 Influence of co-culture and temperature changes on the antibacterial activity of secondary metabolites from MOEF013

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響

2.4.1 不同氮源對(duì)MOEF013提取物抑菌效果的比較

MOEF013在9種不同氮源培養(yǎng)基中培養(yǎng)后經(jīng)乙酸乙酯萃取所得提取物對(duì)6種致病細(xì)菌的抑菌效果差別較明顯 (圖3)?？梢钥闯霾煌囵B(yǎng)基對(duì)MOEF013的次生代謝產(chǎn)物有影響。其中MGY1和MGP培養(yǎng)基培養(yǎng)MOEF013產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)6種致病菌抗菌活性均較好。但MGP培養(yǎng)基培養(yǎng)下提取物的收獲量 (31.2mg)比MGY1培養(yǎng)基的收獲量 (17.1mg)更高,所以確定馬鈴薯粉為培養(yǎng)蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉的最佳氮源。此外,不同氮源下提取物對(duì)不同致病菌的抗菌效果也有差異。除提取物MGM1對(duì)金黃色葡萄桿菌沒(méi)有抗菌活性,MGS提取物對(duì)金黃色葡萄桿菌和福氏志賀氏菌沒(méi)有抗菌活性外,其余氮源所獲得提取物對(duì)6種致病細(xì)菌均有抗菌活性。MGL提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌效果最好,抑菌圈直徑達(dá)19mm。MGB1提取物對(duì)藤黃微球菌抗菌效果較其他氮源都好。副溶血性弧菌對(duì)MGY1,MGM1,MGB1提取物較敏感(圖4)。

圖3 不同氮源培養(yǎng)基下MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性比較Fig.3 Antibacterial activity of MOEF013 secondary metabolites in different nitrogen sources

圖4 不同氮源培養(yǎng)基發(fā)酵提取物對(duì)副溶血性弧菌抑菌效果Fig.4 Antibacterial activity of MOEF013 extracts in different nitrogen sources to Vibrio parahaemolyticus

2.4.2 不同碳源對(duì)MOEF013提取物抑菌效果的比較

分別在9種不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)MOEF013后所得提取物對(duì)6種致病細(xì)菌的抑菌效果有差異(圖5)。

圖5 不同碳源培養(yǎng)基下MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性比較Fig.5 Antibacterial activity of MOEF013 secondary metabolites in different carbon sources

glu為碳源的提取物對(duì)6種致病菌均有抑菌活性。mal為碳源的提取物對(duì)5種致病細(xì)菌有抑菌活性,尤其對(duì)副溶血性弧菌抑制效果顯著,但對(duì)福氏志賀氏菌沒(méi)有抑菌活性。suc培養(yǎng)基所獲提取物對(duì)除藤黃微球菌外的5種致病菌均有抗菌效果,對(duì)無(wú)乳鏈球菌抗菌效果較明顯。man和sor提取物對(duì)4種致病菌有抗菌活性,對(duì)藤黃微球菌和福氏志賀氏菌沒(méi)有活性。luc為碳源所獲提取物對(duì)蠟樣芽胞桿菌和福氏志賀氏菌沒(méi)有抗菌活性,對(duì)其余致病菌均有抑制效果。fru提取物對(duì)藤黃微球菌和福氏志賀氏菌沒(méi)有抑制效果。sta為碳源的提取物對(duì)蠟樣芽胞桿菌和無(wú)乳鏈球菌沒(méi)有抑菌作用。ino為碳源所獲得提取物抗菌活性較差,僅對(duì)蠟樣芽胞桿菌和副溶血性弧菌有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

蒜頭果為我國(guó)特有植物,被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物,僅分布于我國(guó)云南東南部至廣西西部的狹窄地帶,不僅分布極其狹窄,且現(xiàn)存資源量十分稀少[14]。本研究從蒜頭果樹(shù)皮中成功分離獲得植物內(nèi)生真菌—煙曲霉,對(duì)其內(nèi)生真菌煙曲霉發(fā)酵后提取物的抗菌活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)它對(duì)6種人體致病細(xì)菌 (蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、無(wú)乳鏈球菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌)均有抑菌活性,其中對(duì)副溶血性弧菌、藤黃微球菌最低抑制濃度達(dá)到6.25mg/mL。植物內(nèi)生真菌與宿主植物的共生關(guān)系是經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程后相互適應(yīng)的結(jié)果,其代謝產(chǎn)物的種類(lèi)與其宿主植物也息息相關(guān)[15]。不同屬的植物因其內(nèi)環(huán)境的不同,故寄生于不同屬植物的同屬內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物也會(huì)有所不同。例如從禾本科 (Gramineae)植物狗牙根 (Cynodon dactylon)中獲得的內(nèi)生真菌(Aspergillus sp.)能產(chǎn)生3種具抗菌活性的甾類(lèi)化合物,而從紅豆杉 (Taxus mairei)植物中獲得的內(nèi)生真菌 (Aspergillus clavatonanicus)能產(chǎn)生對(duì)多種植物病原菌都有抑制作用的內(nèi)酯化合物 patulin[16]。此外,植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物也受到發(fā)酵條件的影響。林淑婷等發(fā)現(xiàn),不同發(fā)酵條件下,海南粗榧 (Cephataxus hainanensis Li.)中一種內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物種類(lèi)和產(chǎn)量均有明顯差異[17]。因此,本報(bào)道通過(guò)OSMAC策略,探究了我國(guó)瀕危特有物種蒜頭果內(nèi)生真菌MOEF013菌株的最佳發(fā)酵條件,尋找到使其代謝產(chǎn)物活性最好、產(chǎn)量最高的培養(yǎng)條件,在該條件下,MOEF013菌株次生代謝產(chǎn)物對(duì)蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、無(wú)乳鏈球菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌均有良好的抑菌作用。在以往的文獻(xiàn)中,僅見(jiàn)到煙曲霉次生代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌 (Candida albicans)抑菌活性的報(bào)道[18-20]。由新的抗菌活性可以推測(cè),蒜頭果內(nèi)生真菌MOEF013菌株在一定條件下可能產(chǎn)生了新的抗菌化合物。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)MGM1培養(yǎng)基發(fā)酵下所得提取物對(duì)副溶血性弧菌抑菌效果較好,但對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑菌效果,而MGL所得提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯優(yōu)于其他致病菌,因此可以推斷,蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉所產(chǎn)生的抗菌成分不止一種。類(lèi)似的情況在其他微生物中也存在,如謝海平等發(fā)現(xiàn)海洋枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)Bs-1在PDA培養(yǎng)基中發(fā)酵至少產(chǎn)生3種抗真菌活性化合物[21]。綠僵菌 (Metarhizium anisopliae)除了能產(chǎn)生具有抗菌效果的煙曲霉酸 (helvolic acid),還能產(chǎn)生一種煙曲霉酸的衍生物 (1,2-dihydrohelvolic acid)[22]。但本研究中所用的樣品僅為蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉的發(fā)酵液粗提物,對(duì)于起到抗菌作用的究竟有幾種化合物、分別是什么化合物還有待進(jìn)一步的鑒定和研究。在今后的研究中,將大量發(fā)酵蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉,對(duì)其提取物進(jìn)行分離、純化、鑒定等進(jìn)一步研究,確定提取物中抗菌活性成分,并深入研究其抗菌的機(jī)制,以期為新型抗菌藥物提供先導(dǎo)化合物。