雞源致病性奇異變形桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

何欣怡，徐 睿，任 麗，唐 強(qiáng)

（西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)院，四川 西昌 615000）

奇異變形桿菌為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽胞、無(wú)莢膜、周身鞭毛、形態(tài)成明顯多形性，其生長(zhǎng)繁殖對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，4～7℃即可繁殖。該菌廣泛存在于人與動(dòng)物糞便、污水、土壤及臨床標(biāo)本中，其產(chǎn)生的毒素可以引起中毒，是一種常見(jiàn)的條件致病菌。奇異變形桿菌不僅感染雞、鴿、山羊、奶牛和豬等常見(jiàn)家畜，也可感染猴、狐貍、熊貓和水貂等動(dòng)物，在動(dòng)物機(jī)體體抗力下降時(shí)能夠引起外科感染、泌尿系統(tǒng)感染、腹瀉和菌血癥等[1-8]。近年來(lái)，我國(guó)河南、河北、山東、安徽、廣西等地不斷有雞群暴發(fā)奇異變形桿菌病，尤其是在季節(jié)更替、環(huán)境變化、轉(zhuǎn)群和混合感染其他病原時(shí)，雞群體抗力下降，病情加重，病死率升高，給畜禽養(yǎng)殖帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)西昌市月華鄉(xiāng)、興勝鄉(xiāng)、太和鎮(zhèn)、德昌縣王所鄉(xiāng)雞場(chǎng)樣品進(jìn)行奇異變形桿菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)和致病力試驗(yàn)，證明該病原菌為奇異變形桿菌，且篩選出敏感藥物，為污染控制、疾病防治提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購(gòu)置于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂、藥敏紙片均購(gòu)置于杭州微生物試劑有限公司；DL 2000 DNA Marker、2×Tap PCR Master Mix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）、DYY-6C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）、水平電泳槽（北京市六一儀器廠）、切膠儀（天根生化科技（北京）有限公司）等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物3日齡健康雛雞100只。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病料的采集 在西昌市月華鄉(xiāng)、興勝鄉(xiāng)、太和鎮(zhèn)、德昌縣王所鄉(xiāng)雞場(chǎng)對(duì)疑似奇異變形桿菌病的死雞進(jìn)行病理解剖，觀察其內(nèi)部器官，并對(duì)其出現(xiàn)病變的部位如肝臟、腸道、脾臟等器官進(jìn)行病料采集，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 在無(wú)菌的條件下，將病變組織新鮮切面觸壓于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃恒溫恒濕培養(yǎng)16～18 h，挑選單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢。然后再將其接種于麥康凱瓊脂平板，伊紅美藍(lán)瓊脂平板，血平板，37℃培養(yǎng)16～18 h，觀察菌落在平板上的生長(zhǎng)情況及溶血特征，挑取單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，同時(shí)挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃180 r/min，震蕩培養(yǎng)16～18 h，4℃存放備用。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)GenBank中已發(fā)表的序列，奇異變形桿菌16S rRNA通用引物。上游引物B27-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物B-1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

2.3.2 細(xì)菌DNA的制備 按照細(xì)菌基因組DNA試劑盒的步驟對(duì)純化細(xì)菌進(jìn)行DNA提取。細(xì)菌DNA于-20℃存放。

2.3.3 16S rRNA核苷酸序列擴(kuò)增PCR 25 μL反應(yīng)體系：上游引物B27-F：0.5 μL，下游引物B-1492R：0.5 μL，2×Tap PCR Master Mix：12.5 μL，ddH2O：9.5 μL，模板DNA：2 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物-20℃存放。

2.3.4 瓊脂糖凝膠電泳16S rRNA核苷酸序列擴(kuò)增完成后，取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并置于SDS-PAGE凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察條帶的亮度及初略大小，切下瓊脂糖凝膠中目的條帶，送往上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.3.5 序列分析 測(cè)序后，利用NCBI網(wǎng)站中Blast檢索系統(tǒng)對(duì)測(cè)序得到的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析，確定菌株的類(lèi)型。

2.4 藥敏試驗(yàn) 使用kirby-bauer（K-B）紙片法進(jìn)行試驗(yàn)，然后根據(jù)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)將其分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。

2.5 雛雞致病力試驗(yàn) 將100只3日齡的健康雛雞隨機(jī)分成20組，每組5只。1～18組為試驗(yàn)組，19組為試驗(yàn)對(duì)照組，20組為空白對(duì)照組，試驗(yàn)組菌液用滅菌肉湯稀釋到渾濁度與1.0個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粶啙岫纫恢拢ň簼舛燃s為3×108cfu/mL），具體處理方案（如表1）處理后，每隔12 h觀察并記錄1次雛雞的精神狀況及死亡情況，并對(duì)死亡雛雞進(jìn)行病理解剖，無(wú)菌采集心臟、脾臟、肝臟等病變器官及組織，然后分離培養(yǎng)及鑒定，完成菌株的回收。

表1 處理方案Table 1 Plan to deal with

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成乳白色中等大小菌落，菌落邊緣整齊，有明顯遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象，散發(fā)特殊的腐敗性氣味；麥康凱瓊脂形成淡紅色圓形扁平菌落，表面光滑濕潤(rùn)；鮮血平板上呈無(wú)色菌落。鏡檢結(jié)果為的革蘭氏陰性細(xì)菌，以桿狀為主，菌體多兩端鈍圓。詳見(jiàn)圖1～4。

3.2 分子學(xué)鑒定結(jié)果 經(jīng)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增后，用SDS-PAGE凝膠成像系統(tǒng)成像，擴(kuò)增得到的相應(yīng)目的條帶在1 000～2 000 bp之間，與預(yù)期條帶大小初略一致，詳見(jiàn)圖5。經(jīng)上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序后，利用NCBI網(wǎng)站中Blast檢索系統(tǒng)對(duì)測(cè)序得到的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明擴(kuò)增序列與GenBank上其他奇異變形桿菌的核苷酸同源性達(dá)到99%以上。

圖1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板Fig.1 General Nutrition Tablets

圖2 麥康凱平板Fig.2 MacConkey Tablet

圖3 鮮血平板Fig.3 Blood plate

圖4 鏡檢Fig.4 Microscope inspection

3.3 藥敏試驗(yàn) 隨機(jī)挑選3個(gè)不同養(yǎng)殖場(chǎng)共7株奇異變形桿菌對(duì)頭孢類(lèi)、青霉素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及四環(huán)素類(lèi)共6種類(lèi)型抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。根據(jù)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)將其分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。藥敏具體情況見(jiàn)表2。

圖5 16S rRNA電泳圖Fig.5 Electropherogram of 16S rRNA

表2 奇異變形桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug test of Proteusmirabilis

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：7株奇異變形桿菌對(duì)頭孢一代藥物的耐藥率為71.4%；對(duì)頭孢二代藥物的耐藥率為71.4%；對(duì)頭孢三代藥物的耐藥率為14.2%～71.4%；對(duì)青霉素類(lèi)藥物的耐藥率為14.2%～85.0%；對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥率為0.00%～42.8%；對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥率為28.5%；對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)藥物的耐藥率為100%。

3.4 雛雞致病力試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛雞，先后表現(xiàn)不同程度的精神萎靡，食欲減退，羽毛蓬亂，站立不穩(wěn)，且喜臥，并且少數(shù)雛雞死亡后還出現(xiàn)角弓反張（見(jiàn)圖5）等精神癥狀。試驗(yàn)組的雛雞在12 h左右陸續(xù)出現(xiàn)死亡，死亡情況詳見(jiàn)表2。試驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組雛雞精神狀況良好。將死亡的雛雞進(jìn)行病理解剖，發(fā)現(xiàn)主要病變有：脾臟、腎臟有不同程度的腫大；胸腺有出血點(diǎn)（見(jiàn)圖6）；膽囊腫大充盈；肝緣有淤血（見(jiàn)圖7）；腦膜有出血、充血（見(jiàn)圖8）。在無(wú)菌條件下，將死亡雛雞病變器官和組織用涂抹的方式接種于普通瓊脂平板上，分離純化、鑒定，回收到的菌株與注射的菌株一致。

圖 5 角弓反張F(tuán)ig.5 Antagonist

圖 6 胸腺腫大Fig.6 Thymus enlargement

表 3 奇異變形桿菌的致病力試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of pathogenicity test of Proteusmirabilis

圖 7 肝臟淤血Fig.7 Hepatic congestion

圖 8 腦膜出血Fig.8 Meningeal Hemorrhage

4 討論

致病力試驗(yàn)結(jié)果表明，18株奇異變形桿菌中有16株具有致死性，其中致死率高于60%有5株，有4株的致死率為40%，有7株的致死率為20%。奇異變形桿菌為條件致病菌，當(dāng)其與宿主間的生態(tài)平衡在某些情況下被打破，就會(huì)形成生態(tài)失調(diào)，從而正常不致病的正常菌群就成為條件致病菌。細(xì)菌的寄生部位發(fā)生改變、機(jī)體免疫功能下降、菌群失調(diào)[11]都有可能打破這種平衡，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，7株奇異變形桿菌都出現(xiàn)多重耐藥性，但因不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)使用抗生素情況不同，其耐藥情況不完全一致。從總體上看，7株奇異變形桿菌都出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性，表現(xiàn)為同時(shí)對(duì)紅霉素、麥迪霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素共4種抗生素耐藥，其中紅霉素、麥迪霉素、多西環(huán)素的抑菌圈直徑均為0。頭孢類(lèi)藥物的耐藥率為14.2%～71.4%，明顯高于年華等[12]相同藥物5.4%～59.0%的耐藥率，可能由本地區(qū)用藥情況及耐藥菌株的不斷衍化造成。丁胺卡那在試驗(yàn)中表現(xiàn)出高敏性，可作為治療該地區(qū)奇異變形桿菌病的首選藥物。

結(jié)合各采樣場(chǎng)實(shí)際情況，造成細(xì)菌多重耐藥的主要原因可能有以下幾點(diǎn)：①養(yǎng)殖場(chǎng)為了提高動(dòng)物性能、改善飼料轉(zhuǎn)化率、預(yù)防疾病而在飼料中添加大劑量的抗生素；②在治療過(guò)程中盲目使用抗生素，或使用抗生素治療不徹底。

臨床上，應(yīng)加大對(duì)畜禽舍消毒強(qiáng)度，并提高畜禽自身免疫力；在使用抗生素時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格掌握抗菌藥物的類(lèi)型、劑量、給藥次數(shù)、給藥途徑、療程、聯(lián)合用藥及交叉用藥，避免出現(xiàn)超劑量使用、長(zhǎng)期低劑量使用及無(wú)針對(duì)性用藥等濫用抗生素的現(xiàn)象。有條件最好先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感藥物再進(jìn)行治療。