一例牛傳染性鼻氣管炎病毒與大腸桿菌混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

于季申，倪宏波，李 鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163000）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotra-cheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一種急性、熱性、接觸性牛傳染病，傳染性鼻氣管炎也叫做壞死性鼻炎。在臨床上主要表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、鼻炎和上呼吸道炎癥，還可以引起膿包性外陰陰道炎、龜頭炎、母牛流產(chǎn)、死胎及犢牛腦炎、共濟(jì)失調(diào)，有時(shí)發(fā)生結(jié)膜炎和角膜炎等癥狀。IBRV感染宿主細(xì)胞的特性與其所含有的病毒蛋白及其誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的病理反應(yīng)有密切的關(guān)系[1]；IBRV糖蛋白gD是其重要的毒力因子[2]，是主要的誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的單純皰疹病毒1型UL6蛋白區(qū)域相似的結(jié)構(gòu)域，提示該蛋白可能與病毒的組裝有關(guān)，IBRV除了通過呼吸道黏膜上皮及生殖道上皮感染宿主外，也可通過空氣及牛之間的接觸進(jìn)行傳播，通過一系列方式建立感染[3]。

犢牛大腸桿菌病是由多種血清型的致病性大腸桿菌所引起的急性新生幼犢傳染病。多見于2周齡內(nèi)的初生犢牛，舍飼牛群多發(fā)，放牧條件下發(fā)病較少，肉牛的發(fā)病率高于奶牛[4]。犢牛腹瀉大腸桿菌有多種血清型，主要有導(dǎo)致初生犢牛腹瀉的O8、O9、O20、O101大腸桿菌，感染犢牛發(fā)生敗血癥的O78、O15、O35、O115、O117、O137等血清型大腸桿菌[5]犢牛腹瀉是出生后至1個(gè)月內(nèi)犢牛因不適應(yīng)外界環(huán)境某些不良因素的影響而發(fā)生的一種以消化不良、腹瀉為主要癥狀的消化道疾病，并以4～10日齡為多發(fā)，病犢以體溫升高（消化不良型腹瀉初期體溫沒有明顯變化）、腹瀉、脫水、自體中毒及心力衰竭為主要特征，是造成犢牛死亡的主要疾病之一[6]。很多急性犢牛腹瀉是由細(xì)菌和病毒混合感染而引起的，而這些細(xì)菌和病毒在健康犢牛腸道內(nèi)是普遍存在的。在細(xì)菌性腹瀉病中，由大腸桿菌引起的腹瀉占據(jù)首位[7-9]。由于犢牛腹瀉在許多養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的國家都有發(fā)生，給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。長期以來抗生素和化學(xué)治療藥物是防治該病的常用藥物，并取得了良好的效果[11]。

本試驗(yàn)根據(jù)對軍川牧場完達(dá)山牧業(yè)某牛場的流行病學(xué)調(diào)查以及送檢的9個(gè)牛糞便樣本和9個(gè)?？诒欠置谖锏腜CR病原鑒定、平板培養(yǎng)基劃線法的細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)確診其發(fā)病原因是該牛同時(shí)感染牛IBRV病毒和大腸桿菌，肉牛傳染性鼻氣管炎也叫做壞死性鼻炎，是由于感染牛傳染性鼻氣管炎病毒而引發(fā)的一種病毒性疾病。犢牛感染病毒后，會(huì)呈現(xiàn)潛伏感染或者持續(xù)性感染，導(dǎo)致病牛長時(shí)間甚至終生攜帶或者排出病毒，很難徹底控制或者消滅該病，造成較高的死亡率，嚴(yán)重?fù)p害養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)采取有效的防治措施。在自然感染的條件下，只有牛對該病具有易感性，通常是育肥肉牛容易發(fā)生。該病往往呈急性發(fā)生，具有傳染性，該牛場環(huán)境消毒不合格，免疫程序混亂，沒有經(jīng)過科學(xué)的疫苗免疫程序，這些因素給病原提供大量繁殖并發(fā)生變異的機(jī)會(huì)，造成IBRV病原存在牛只體內(nèi)，沒有及時(shí)確診，帶病牛沒有被及時(shí)隔離導(dǎo)致大規(guī)模的病毒擴(kuò)散和傳播，從而大規(guī)模牛群體感染IBRV病毒，該牛場飼養(yǎng)管理水平低，飼養(yǎng)密度大，飼料不科學(xué)；排泄物沒有無害化處理，導(dǎo)致造成大腸桿菌細(xì)菌感染，現(xiàn)將診斷過程匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 軍川牧場送檢的3月齡犢牛糞樣和口鼻分泌物樣本，實(shí)驗(yàn)室無菌采集牛的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸以及血液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)材料 DL 2000 DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotra-cheitis,IBR）、牛呼吸道合胞體（respirator syncytial）、牛副流感病毒（Parainfluenza virus）、輪狀病毒（Rotavirus）、冠狀病毒（coronavirus）、腺病毒（Adenovirus）、牛流行性腹瀉病毒（Bovine epidemic diarrhea virus）的基因序列設(shè)計(jì)特異引物。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌剪取一小塊深部組織臟器，接種涂抹于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上，分別做需氧和厭氧培養(yǎng)，置37℃恒溫箱中24 h，同時(shí)用接菌環(huán)挑取腸內(nèi)容物接種在SS和麥康凱培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血情況等，挑取疑似菌的單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.5 核酸的提取與PCR鑒定

1.5.1 口鼻分泌物以及糞便的DNA和RNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit操作進(jìn)行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒進(jìn)行提取RNA，DNA-20℃保存?zhèn)溆?，RNA-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增 按RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA在-20℃進(jìn)行保存?zhèn)溆?。用得到的DNA和cDNA為模板，牛傳染性鼻氣管炎、牛呼吸道合胞體、牛副流感、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛流行性腹瀉病毒和牛腺病毒特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，取10 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 引物序列Table 1 Peimersequence

1.6 細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 將鑒定為大腸桿菌的純培養(yǎng)物用接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片（鹽酸林可霉素、恩諾沙星、恩諾殺星、硫酸慶大霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、鹽酸頭孢噻呋鈉、卡那霉素、硫酸鏈霉素、氨芐西林鈉）分別貼于平皿中，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

注：抑菌環(huán)直徑＜15 mm為低度敏感；≥15 mm為高度敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂片染色特性 將病料中所分離的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，進(jìn)行革蘭氏染色、涂片、鏡檢?？梢姷礁锾m氏染色陰性桿菌，中等大小，直桿菌（見圖1）。由于大腸桿菌和沙門氏菌的形態(tài)及染色特征十分相似，所以為了區(qū)分這兩種細(xì)菌，又分別接種于SS和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，結(jié)果為SS培養(yǎng)基長出深粉色，光澤菌落；麥康凱培養(yǎng)基長出粉色、光滑、圓形菌落（見圖2、圖3）

圖1 革蘭氏染色兩端鈍圓桿狀菌（10×10）Fig.1 Gram staining at both ends of blunt rod-shaped baculovirus

圖2 SS瓊脂培養(yǎng)基深粉色、圓形菌落Fig.2 SS agar medium deep pink and round colony

2.2 PCR檢測結(jié)果 以組織中提取的病毒DNA以及病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別選用牛傳染性鼻氣管炎、牛呼吸道合胞體、牛副流感、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛流行性腹瀉病毒和牛腺病毒特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，輪狀病毒、冠狀病毒、BVDV病毒、腺病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒無陽性結(jié)果（如圖4、圖5）。其中IBRV病毒結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在第6孔道和第9孔道與牛傳染性鼻氣管炎預(yù)期片段大小相符（如圖6）。

圖3 麥康凱培養(yǎng)基 圓形菌落粉紅色、光滑F(xiàn)ig.3 Makanke culture base round colony pink and smooth size colony

2.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖 4PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 PCR electrophoresis analysis chart

圖5 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.5 PCR electrophoresis analysis chart

圖6 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.6 PCR electrophoresis analysis chart

表2 藥敏結(jié)果Table 2 The results of drug susceptibility

3 討論

3.1 發(fā)病原因 對該牛場牛犢的發(fā)病原因進(jìn)行調(diào)查：該牛場飼養(yǎng)管理水平低，飼養(yǎng)密度大，飼料不科學(xué)；環(huán)境消毒不合格，排泄物沒有無害化處理；免疫程序混亂，沒有經(jīng)過科學(xué)的疫苗免疫程序。這些因素給病原和細(xì)菌提供大量繁殖并發(fā)生變異的機(jī)會(huì)，牛只被IBRV病原感染，沒有及時(shí)診斷對癥治療或隔離，造成牛場牛群大規(guī)模病毒傳播擴(kuò)散，牛群感染IBRV。

3.2 防治措施 牛傳染性鼻氣管炎的治療目前尚無特殊藥物和療法，根本的辦法是消滅傳染源，對健康牛進(jìn)行免疫注射。因此采取檢疫、隔離、封鎖、消毒等綜合性措施。應(yīng)堅(jiān)持自繁自養(yǎng)原則。為防控該病，要進(jìn)行無害化處理，被污染的圈舍、器具要進(jìn)行消毒，糞便要進(jìn)行堆積發(fā)酵處理，牛場環(huán)境要經(jīng)常消毒，疫情嚴(yán)重威脅時(shí)，每天消毒1次，連續(xù)消毒1周，以后夏天每周2次，冬天1次；牛舍凈化。在多數(shù)牛場尚無多點(diǎn)生產(chǎn)體系情況下，保育舍和育肥舍要做到單元式全進(jìn)全出生產(chǎn)管理，即每個(gè)牛舍的用具、人員等要獨(dú)立，用具不可共用，人員不要來往[12-13]。

應(yīng)定期對牛群進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測，對陰性?？刹扇∫呙缱⑸洌栃耘Ｈ绻麛?shù)量較少，可及時(shí)淘汰，集中飼養(yǎng)，對已發(fā)病的犢牛應(yīng)予以屠宰。而對發(fā)病死亡的牛尸體必須進(jìn)行無害化處理[14-15]。

4 結(jié)論

通過對牛場牛的病情和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診送檢的病死牛死亡原因是該牛感染了牛傳染性鼻氣管炎和大腸桿菌，該牛場病牛呼吸困難、流鼻涕、高死亡率具有牛傳染性鼻氣管炎的典型特征，腹瀉拉稀具有大腸桿菌感染的特征，呼吸系統(tǒng)疾病和消化道系統(tǒng)疾病混合感染往往很難治療，牛傳染性比氣管炎具有高度的傳染性，要想防治該病毒發(fā)生和擴(kuò)散，必要時(shí)要及時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，及早隔離帶病牛進(jìn)行規(guī)?；靖綦x飼養(yǎng)，一旦遇到犢牛與該病有相似癥狀要及時(shí)對癥治療。