研制新型布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡方法的建立與應(yīng)用

魏園園

（遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164）

布魯氏菌病（Brucellosis）是世界范圍內(nèi)非常重要的人畜共患病之一，屬自然疫源性疾病。布魯氏菌（Brucella）是布魯氏菌病的病原菌，在自然條件下可長期潛伏存在[1]，在我國被列為二類動物疫病。國內(nèi)的布魯氏菌檢測通常采用推斷性診斷方法是虎紅平板凝集試驗(yàn)（Rose bengal test，RBPT）和試管凝集試驗(yàn)（Slide agglutination test，SAT），但由于檢測時間、血清樣品用量大以及陽性檢出率低等方面限制，使這兩種方法具有一定的局限性[2-3]。酶聯(lián)免疫 方 法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）一直是布魯氏菌快速檢測的推薦方法之一，很多學(xué)者對其在布魯氏菌的酶聯(lián)免疫檢測方法上進(jìn)行了優(yōu)化[4]和評價[5]。劉佳等[6]通過對比試驗(yàn)證明ELISA抗體檢測優(yōu)于RBPT、SAT檢測方法。除此之外，PCR檢測方法也是布魯氏菌的檢測方法之一[7]。

1971年Holgate等[8]將膠體金方法引入了免疫學(xué)領(lǐng)域，此后膠體金免疫技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)的各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用[9]。目前，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法（immunochromatography assay）和快速免疫金滲濾法（Dot-immuogold filtration assay，DIGFA），用于檢測HBsAg、HCG和抗雙鏈DNA抗體等，具有簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)。膠體金免疫檢測在布病檢測中也相繼進(jìn)行了研發(fā)。通過對比其與金標(biāo)免疫滲濾法和試管凝集試驗(yàn)，得出結(jié)論膠體金免疫方法具有試劑靈敏度和特異性，且其很小的血清用量（10 μL）更適用于臨床應(yīng)用[10]。由于膠體金技術(shù)優(yōu)良的穩(wěn)定性、靈敏度、精確度及制造過程中的可重復(fù)性，被廣泛地應(yīng)用在酶聯(lián)免疫快速檢測卡的生產(chǎn)上[11]，適合于廣大基層檢驗(yàn)人員以及大批量檢測和大面積普查等。

本試驗(yàn)研發(fā)了一種高效快速的布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡，并配合膠體金試紙卡讀數(shù)儀進(jìn)行結(jié)果判定，進(jìn)行了靈敏度、穩(wěn)定性和批次間穩(wěn)定性等試驗(yàn)，此外還結(jié)合虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行了對比，對這一市場新產(chǎn)品進(jìn)行了評價。

1 試驗(yàn)材料

1.1 主要試劑和儀器三維劃膜噴金儀HM3030、金標(biāo)試紙分切機(jī)WM-100（上海金標(biāo)）；連續(xù)點(diǎn)膜機(jī)R5DD-2（韓感）；膠體金試紙卡讀數(shù)儀GA01來自北京大有泰萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、陽性血清、陰性血清、豬藍(lán)耳病陽性血清，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)。布魯氏菌抗體ELISA試劑盒，北京大有泰萊生物技術(shù)有限公司。其他建立膠體金免疫層析方法的試劑和耗材由北京金申中合科技有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 膠體金檢測卡的制備

2.1.1 4B8單克隆抗體IgG雜交瘤細(xì)胞株建立參考方法[12]進(jìn)行免疫、細(xì)胞融合、克隆和單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株制備。參考方法[11]進(jìn)行抗體的純化及包被。

2.1.2 膠體金溶液的制備量取40 mL純水，加熱至沸騰后，加入0.04 mL 10%氯金酸溶液。于5 min后加入0.096 mL的10%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮10 min。待溶液溫度降至室溫后，將pH調(diào)節(jié)至8.2，裝入棕色瓶中，于室溫保存。

2.1.3 抗體與膠體金結(jié)合 取1.5 mL離心管，加入膠體金500 μL，加入30 μg/mL的抗體溶液，混勻后于室溫下放置15 min。加入100 μL 10%NaCl，放置10 min。

2.1.4 檢測卡的制作和組裝 參照方法[13]進(jìn)行金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備、劃膜和檢測卡組裝工作，將檢測卡置于裝有干燥器的自封袋中備用。

2.2 膠體金檢測卡評價

2.2.1 靈敏度評價將布魯氏菌陽性血清制備至試管凝集試驗(yàn)1:400效價后，用0.01 mol/L PBS稀釋為1:400、1:200、1:100、1:50、1:25、1:12.5、1:6.25、1:3.125、1:1.56、1:0.78、1:0.39、1:0.2、1:0.1和1:0.05后，分別進(jìn)行布魯氏菌抗體膠體金檢測卡的檢測：在檢測板加樣孔中加10 μL被檢血清，4 min后將顯色后的試紙卡插入膠體金試紙卡讀數(shù)儀，進(jìn)行讀數(shù)后記錄數(shù)據(jù)，以血清濃度為橫坐標(biāo)、T/C值為縱坐標(biāo)，用RIDAWIN軟件（Biopham，美國）擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，進(jìn)行靈敏度評價。以下試驗(yàn)的膠體金讀數(shù)儀數(shù)值將依照此判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2.2.2 特異性評價 將豬藍(lán)耳病陽性血清進(jìn)行布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡檢測。

2.2.3 批內(nèi)和批間重復(fù)性評價 將同批和不同批次的布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡分別檢測上述陰性樣品、陽性樣品、實(shí)測陽性樣品，每個濃度重復(fù)3次，觀察其重復(fù)性。

2.2.4 臨床樣品靈敏度評價選取22份布魯氏菌抗體ELISA試劑盒（北京，大有泰萊）測定為陽性的羊血清樣本，利用布魯氏菌抗體膠體金檢測卡檢測。陽性對照為實(shí)驗(yàn)室保存的1:400效價的陽性血清；陰性對照為布魯氏菌抗體ELISA試劑盒檢測的布魯氏菌為陰性的牛血清。

選取20份布魯氏菌抗體ELISA試劑盒測定為陰性的羊血清樣本，利用布魯氏菌抗體膠體金檢測卡檢測。陽性對照為實(shí)驗(yàn)室保存的1:400效價的陽性血清；陰性對照為布魯氏菌抗體ELISA試劑盒檢測的布魯氏菌為陰性的牛血清。

2.3 膠體金檢測卡和虎紅平板檢測方法的靈敏度評價對比按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)（GB/T18646-2002）》中的方法進(jìn)行虎紅平板凝集方法檢測。在載玻片上滴加0.03 mL被檢血清后，滴加0.03 mL虎紅平板抗原，搖勻靜置，4 min后判定結(jié)果。室溫條件下操作，肉眼觀測進(jìn)行判定。將2.2.1同樣血清濃度利用虎紅平板試驗(yàn)進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果與膠體金檢測卡結(jié)果對比。

選用2.2.4的22份臨床陽性樣本進(jìn)行虎紅平板凝集方法檢測，并將檢測結(jié)果與膠體金檢測卡結(jié)果對比。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 膠體金檢測卡靈敏度評價

3.1.1 靈敏度評價將檢測卡從1:400效價血清以2倍倍比稀釋，試紙可以檢測至1:0.39稀釋度（圖1）。

3.1.2 靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線確立將陽性血清按照1:400、1:200、1:100、1:50、1:25、1:12.5、1:6.25、1:3.125、1:1.56、1:0.78、1:0.39、1:0.2、1:0.1、1:0.05的2倍倍比稀釋。利用讀卡儀進(jìn)行T/C值記錄，以T/C值為縱坐標(biāo)，血清濃度為橫坐標(biāo)，使用RIDAWIN軟件（Biopham，AZ，US）擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=1.884+0.144lnX（R2=0.9910），最低檢出限為1:0.39，即判定標(biāo)準(zhǔn)為膠體金試紙卡讀數(shù)儀的T/C值≥0.14為陽性。

3.1.3 膠體金檢測卡和虎紅平板的靈敏度評價為了對比布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡和虎紅平板檢測方法的靈敏度，將試管凝集試驗(yàn)1:400效價的陽性血清做2倍倍比稀釋。通過對照判定標(biāo)定值，膠體金可檢測到第11個稀釋度1:0.39，虎紅平板凝集試驗(yàn)可檢測到第6個稀釋度1:12.5（圖2）。結(jié)果表明布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于虎紅平板，更適合于布魯氏菌的快速檢測。

圖1 布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡的靈敏度試驗(yàn)Fig.1 Sensitivity test of the colloidal gold strips test on Brucella serum

圖2 布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡和虎紅平板的靈敏度對比試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test of rose bengal plate agglutination test onBrucella

3.2 膠體金快速檢測卡和虎紅平板的陽性檢出率對比試驗(yàn)為了對比布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡和虎紅平板檢測對于已知陽性樣本的陽性檢出率，本試驗(yàn)將這兩種方法分別檢測了22份布魯氏菌臨床陽性羊血清樣本。通過對比金標(biāo)儀曲線值，得出結(jié)論：布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡在22份陽性樣品中分別檢測出陽性率90.91%，而虎紅平板檢測方法陽性率為81.81%（表1）。

在20份布魯氏菌抗體ELISA試劑盒測定為陰性的羊血清樣本中，布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡和虎紅平板檢測方法的陽性檢出率均為0%，陰性檢出率均為100%。

表1 陽性樣本布魯氏菌抗體膠體金檢測卡通過讀卡儀的判定結(jié)果和虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果Table 1 colloid gold reader result on colloidal gold strips test and rose-bengal plate agglutination test

通過對比膠體金布魯氏菌快速檢測卡和虎紅平板檢測方法的已知陽性樣本的陽性檢出率，得出結(jié)論：膠體金檢測卡的陽性檢出率高于虎紅平板檢測方法9.10%，更適合于布魯氏病的臨床快速檢測。

3.3 布魯氏菌膠體金快速檢測卡的特異性評價豬藍(lán)耳病陽性血清的布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡檢測結(jié)果為陰性。

3.4 布魯氏菌膠體金快速檢測卡的批內(nèi)和批間重復(fù)通過對比3個批次的布魯氏菌抗體膠體金快速檢測卡，批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性及色度辨析度良好，檢出率一致。

4 討論

本試驗(yàn)應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，成功建立了針對布魯氏菌抗體的膠體金檢測卡方法，大大降低了檢測時間和檢測成本。通過陽性樣本的梯度濃度判讀結(jié)果表明，將試管凝集試驗(yàn)1:400效價的陽性血清做2倍倍比稀釋，布魯氏菌抗體膠體金檢測卡的靈敏度為第11個稀釋度；其檢測最快觀察時間為3 min；通過多批次檢測卡測試，批內(nèi)和批間重復(fù)性為100%；陽性檢出率為90.91%。本試驗(yàn)證實(shí)，本自研布魯氏菌抗體膠體金檢測卡的靈敏度低于ELISA，高于虎紅平板凝集試驗(yàn)，靈敏度是虎紅平板凝集試驗(yàn)的32倍，可用于布魯氏菌臨床樣品的臨床快速檢測，是布病檢測工作的檢測利器。

董浩等[14]通過對比虎紅平板和膠體金免疫層析法在牛血清和羊血清的陽性檢測率試驗(yàn)，證明膠體金免疫層析法的檢出率高于虎紅平板凝集試驗(yàn)，初步證實(shí)膠體金敏感度高于凝集試驗(yàn)。制作的布氏桿菌抗體膠體金免疫層析方法與虎紅平板相比具有更高的陽性率。除此之外，由于目測檢測卡結(jié)果受到光線、個人視力辨識度等因素影響，容易存在錯錄和漏錄等風(fēng)險。采用了膠體金讀卡儀，通過靈敏度對照圖確定了陽性讀數(shù)值，避免了個人因素影響，增加了檢測的準(zhǔn)確度，可作為未來疫病檢測的推薦使用方法。