響應(yīng)面法優(yōu)化云南宣木瓜齊墩果酸和熊果酸的提取工藝研究

羅小芳，郭乙穎，胡柳，王釵，宋艷芝，李治章，2，王宗成，*

（1.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州425199；2.湖南科技學(xué)院湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南永州425199；3.湖南科技學(xué)院湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南永州425199）

宣木瓜是薔薇科木瓜屬植物，是集藥用食用的植物，主要產(chǎn)于安徽，四川，云南，湖北等地，種植面積廣泛，木瓜色香味俱佳，有“嶺南果王”之稱。藥典記載：宣木瓜性溫、味酸澀，有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)濕痹等癥[1-2]。木瓜中含有多種氨基酸和營養(yǎng)物質(zhì)，而且還含有多種活性物質(zhì)，如齊敦果酸、熊果酸具有抗癌、提高免疫力降血脂、降血糖的功效[3]。我國目前宣木瓜用量不大，大多宣木瓜腐爛丟棄，造成不小的浪費，因此從木瓜中提取齊敦果酸和熊果酸對于開發(fā)木瓜的藥用價值，以及其副產(chǎn)物的綜合利用有重要的意義。

齊墩果酸和熊果酸是互為同分異構(gòu)體的兩種五環(huán)三萜類脂溶性化合物[4]，目前齊墩果酸與熊果酸的提取方法主要有回流提取法、超聲輔助法和微波輔助提取法等[5]。超聲波提取技術(shù)屬新興的生物提取技術(shù)，工作原理是利用超聲波的機械效應(yīng)，空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運動速度、介質(zhì)的穿透力提取生物有效成分，具有操作簡便、提取效率高、有效成分不被破壞等優(yōu)點[6-9]。本試驗研究以超聲波輔助快速提取宣木瓜中的齊墩果酸和熊果酸，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理[10-12]，用響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為工業(yè)化提取齊墩果酸和熊果酸提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

FV-SV-360超聲細(xì)胞破碎儀：寧波新芝儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津；JFSD-100粉碎機：江陰市豐華藥化機械有限公司；YP1200分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；WG-71新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

宣木瓜：采買自云南大理，清洗干凈，去籽切片，并放在恒溫干燥箱中干燥，干燥后粉碎過40目篩；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國默克；無水乙醇、乙酸銨（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1 齊墩果酸和熊果酸的提取工藝

宣木瓜→干燥→粉碎→過篩40目→精密稱取干燥、粉碎、過篩的宣木瓜→置于燒杯內(nèi)→按單因素控制試驗條件→稱重→置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中提取→補失重→過微濾膜→取續(xù)濾液→供試品溶液→按藥典方法進(jìn)行檢測

2.2 高效液相色譜分析方法[13]

2.2.1 齊墩果酸和熊果酸含量測定的液相條件

色譜柱：島津 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（80∶20，體積比）；流速：0.8 mL/min；柱溫：18℃；檢測波長：210 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

2.2.2.1 齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品11.0 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至 10 mL。分別精密吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，分別進(jìn)樣 10 μL。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程。

2.2.2.2 熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.9 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至 10 mL。分別精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，分別進(jìn)樣 10 μL。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程。

3 結(jié)果與討論

3.1 齊墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（mAU·s）為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1～圖2），并進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程。

齊墩果酸 y=493 101x+2 553.4（R2=0.999 9），表明齊墩果酸在0.06 μg～0.39 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。熊果酸 y=569 380x-4 920（R2=0.999 8），結(jié)果表明，熊果酸在 0.11 μg～0.76 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

圖2 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ursolic acid

圖3 乙醇濃度、液料比、超聲功率及超聲時間對齊墩果酸和熊果酸提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration，liquid-to-solid ratio，ultrasonic power and ultrasonic time on the yield of oleanolic acid and ursolic acid

3.2 單因素試驗及結(jié)果

乙醇濃度、液料比、超聲功率及超聲時間對齊墩果酸和熊果酸提取效果的影響見圖3。

3.2.1 乙醇濃度對提取效果的影響

固定超聲破碎提取時間 3 min，液料比 20∶1（mL/g）與超聲功率480 W，考察不同乙醇濃度對齊墩果酸與熊果酸提取得率的影響（見圖3A）。由圖3A可知，乙醇濃度為60%～90%時，齊墩果酸與熊果酸的提取得率都隨乙醇濃度的提高而增加。乙醇濃度為90%時，二者的提取得率最高，繼續(xù)增加乙醇濃度，其提取得率幾乎沒有變化。齊墩果酸與熊果酸均溶于乙醇，不溶于水，兩者隨乙醇濃度的提高，溶解度相應(yīng)增大，提取得率也隨之提高[8]。因此，中心組合試驗選取乙醇的體積分?jǐn)?shù)范圍為80%～100%。

3.2.2 液料比對提取效果的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，超聲提取時間3 min與超聲功率480 W，考察不同液料比對齊墩果酸與熊果酸提取得率的影響（見圖3B）。圖3B可以看出，當(dāng)液料比從 10∶1（mL/g）增加至 20∶1（mL/g）時，齊墩果酸與熊果酸提得率均相應(yīng)的提高，繼續(xù)增加液料比，齊墩果酸與熊果酸提取得率變化不明顯。增大液料比可以提高有效成分的擴散速度，有助于齊墩果酸與熊果酸從基質(zhì)中溶出，考慮到提取液濃縮所需的能耗，中心組合試驗選擇液料比為 20∶1（mL/g）。

3.2.3 超聲功率對提取效果的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù) 90%，液料比 20∶1（mL/g）與超聲提取時間3 min，考察不同超聲功率對齊墩果酸與熊果酸提取得率的影響（見圖3C）。圖3C可以看出，當(dāng)超聲功率從240 W增加至480 W時，齊墩果酸與熊果酸提得率均相應(yīng)的提高，繼續(xù)增加超聲功率，齊墩果酸與熊果酸提取得率反而有所下降。增大超聲功率可以提高植物細(xì)胞的破碎度，有助于齊墩果酸與熊果酸從基質(zhì)中溶出，但超聲功率過高會破壞齊墩果酸與熊果酸的結(jié)構(gòu)，降低提取得率。因此中心組合試驗選擇超聲功率的范圍為360 W～600 W。

3.2.4 超聲時間對提取率的影響

固定乙醇濃度 90%，液料比 20∶1（mL/g）與超聲功率480 W，考察不同超聲提取時間對齊墩果酸與熊果酸提得率的影響（見圖3D）。由圖3D可知，隨著超聲提取時間的延長，空化效應(yīng)產(chǎn)生大量的新生表面，提取液的溫度升高，加速了有效成分的溶解與擴散，提取得率逐漸提高；當(dāng)時間達(dá)到3 min時，齊墩果酸與熊果酸的提取得率均為最高，說明此時已達(dá)到提取平衡[12]。此后再延長時間，齊墩果酸與熊果酸的提取得率變化不明顯。因此，中心組合試驗選擇提取時間的范圍為 2 min～3 min。

3.3 響應(yīng)面分析試驗及結(jié)果

3.31 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計

綜合單因素試驗結(jié)果，液料比對齊墩果酸與熊果酸的提取得率影響較小，因此固定液料比為20∶1（mL/g），然后根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取乙醇濃度、超聲功率、超聲時間3個因素為自變量，齊墩果酸和熊果酸相加的總得率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的二次回歸方程來擬合自變量與總得率之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化提取工藝。各因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

3.3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

以 A（乙醇濃度）、B（超聲功率）、C（超聲時間）為自變量，以齊墩果酸和熊果酸的總得率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，試驗結(jié)果見表2，并利用軟件對結(jié)果進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 響應(yīng)面設(shè)計回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表2中共有17個試驗組合，1～12為分析因試驗，13～17為零點試驗。采用Design Expert8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由此可求出影響因素的一次項、二次項及其交互項的關(guān)聯(lián)方程為：齊墩果酸和熊果酸的總得率=3.85＋0.27A＋0.11B＋0.35C－0.10AB－0.21AC－0.13BC－0.16A2－0.043B2－0.15C2。

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見由表3，可知超聲時間、超聲功率、乙醇濃度3個因素對齊墩果酸和熊果酸提取總得率的影響順序為：超聲時間＞乙醇濃度＞超聲功率。且3個因素對齊墩果酸和熊果酸提取總得率影響極顯著；超聲時間和乙醇濃度二次項對齊墩果酸和熊果酸提取總得率的影響均達(dá)到極顯著水平；交互項對得率的影響均達(dá)到顯著水平。模型回歸P值＜0.000 1差異極顯著，失擬項P值=0.183 8>0.05，又有模擬決定系數(shù)R2=0.991 6，說明該模型齊墩果酸和熊果酸總得率的變化99.16%來自所選因變量，且與實際情況擬合很好，能夠正確反應(yīng)齊墩果酸和熊果酸得率與超聲時間、乙醇濃度及超聲功率之間的關(guān)系。因此，可用該模型對齊墩果酸和熊果酸的最佳試驗工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

3.2.4 響應(yīng)面曲面分析

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值Y與對應(yīng)的試驗因素A、B、C構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高圖，將一個因素固定在零水平，對另外兩個因素進(jìn)行分析，從中可以直觀地反映各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響，利用Design Expert軟件作出響應(yīng)曲面及等高線圖。各因素交互作用響應(yīng)面和等高線圖如圖4。

圖4比較可知，超聲時間對齊墩果酸和熊果酸提取的總得率的影響曲線相對較陡，影響最為顯著；其次是乙醇濃度，而超聲功率對齊墩果酸和熊果酸提取的總得率的影響曲線相對平滑，影響較小。

由軟件分析可得，提取齊墩果酸和熊果酸的最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度95.56%，超聲時間3.79 min、超聲功率440 W，在此條件下，齊墩果酸和熊果酸的理論得率為4.05 mg/g。

圖4 各提取因素之間的交互作用影響Fig.4 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of total yield of oleanolic acid and ursolic acid

3.4 驗證試驗

為了檢驗試驗結(jié)果與真實情況是否一致，根據(jù)上述分析結(jié)果進(jìn)行驗證試驗，考慮到實際操作情況，確定提取齊墩果酸和熊果酸的最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度95%，超聲時間3.8 min、超聲功率440 W，在此條件下進(jìn)行6次平行試驗，齊墩果酸和熊果酸提取的總得率4.03 mg/g；與理論預(yù)測值接近。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化所得的超聲輔助提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實用價值。

4 結(jié)論

采用超聲輔助提取宣木瓜中的齊墩果酸和熊果酸，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析對提取齊墩果酸和熊果酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到齊墩果酸和熊果酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度95%，超聲時間3.8 min、超聲功率440 W，測得的齊墩果酸和熊果酸的實際總得率為4.03 mg/g，與理論基本相符。