小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素的氣相色譜法檢測及毒素污染去除分析

張正煒，成 瑋，沈慧梅，田如海，武向文，郭玉人，占繡萍,2*

(1.上海市農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心，上海 201103；2.上海市農(nóng)藥檢定所，上海 201103)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種B型單端孢霉烯族真菌毒素，對動物和人都具有很強的致嘔吐能力，因此又被稱為“嘔吐毒素(Vomitoxin)”。DON主要存在于小麥、大麥、燕麥、黑麥、玉米、大米等谷物及其制品中，在全球范圍內(nèi)具有很高的污染率。我國谷物在田間普遍存在鐮刀菌毒素污染，小麥被感染鐮刀菌后成為赤霉病變，我國谷物及其制品如玉米、玉米面(渣、片)、大麥、小麥、麥片、小麥粉中DON的限量標準為≤1mg/kg[1]。

有關谷物中的分析方法，文獻報道了氣相色譜(GC)[2-7]、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[8-9]、液相色譜(HPLC)[10-18]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[18-21]、液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[22-25]等多種方法，文獻中色譜法所采用的樣品預處理較為復雜，都需要經(jīng)過不同程度的凈化，使用較為昂貴的固相萃取小柱和耗費大量的有機溶劑。然而GC-MS、LC-MS等質(zhì)譜儀器非常昂貴，很多基層檢測機構(gòu)不能配置到位。本文通過氣相色譜儀檢測，前處理方法通過反復篩選提取方式、提取時間，指出衍生化的關鍵點，優(yōu)化色譜條件，無需凈化，簡化了操作步驟，縮短了樣品處理時間。適合基層檢測機構(gòu)實驗室快速開展日常的小麥DON監(jiān)管工作。

通過市場面粉抽檢發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)品牌面粉都不同程度的含有DON毒素；對小麥進行田間調(diào)查與取樣中發(fā)現(xiàn)，看似健康的麥粒中，同樣極有可能感染著DON毒素的風險，有些甚至超過國家標準，所以從食品安全角度考慮，農(nóng)業(yè)政府部門應該嚴格監(jiān)測與監(jiān)管小麥等谷物及其制品中DON含量。

1 材料與方法

1.1 儀器 GC7890氣相色譜儀帶ECD檢測器(美國安捷倫公司)、色譜柱HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)、中藥粉碎機(上海淀久中藥機械制造有限公司)、離心機(上海安亭科學儀器廠)、漩渦混合器(上海皓莊儀器有限公司)、搖床(德國Julobo振蕩水浴)、數(shù)控超聲波清洗器(昆山和創(chuàng)超聲有限公司)、電子天平(Sartorius公司)等。

1.2 樣品與試劑耗材 小麥粉陰性和陽性樣品：農(nóng)戶種植和超市、農(nóng)貿(mào)市場購買。

DON標準品(純度>99%，F(xiàn)ERMENTEK Ltd，for research use only)；三甲基硅烷咪唑TMSI(純度≥98.0%,上海麥克林生物有限公司)和三甲基氯硅烷TMCS(分析純，上海潤捷化學試劑有限公司)，異辛烷(色譜純)，實驗用水為Millipore制備的超純水，0.22μm的有機濾膜，一次性針筒。

DON標準儲備液：用甲醇將DON標準品配制成20mg/L的DON標準儲備液，置于-20℃的冰箱保存，使用時稀釋成所需質(zhì)量濃度的DON標準工作液。

衍生化混合試劑配制：將三甲基硅烷咪唑TMSI和三甲基氯硅烷TMCS以100:1(體積比)混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 將脫殼后的小麥粒均勻打磨成面粉，面粉稱取5 g，加入乙腈/水(ν:ν=84:16)溶液25 mL，超聲波超聲15min或置于搖床上振蕩2 h。再以5 000 r/s的速度將樣品離心2 min，吸出上清液5mL至離心管中，置于60℃水浴鍋中氮吹至干(或者置于通風廚過夜)，樣品須充分吹干，不可有水分，否則影響下一步反應。

1.3.2 衍生化 在樣品管加入0.5 mL以上混合好的衍生化試劑，在漩渦混合器振蕩1 min令充分反應。加入異辛烷5 mL，充分搖晃后，以5 000 r/min離心1 min。再在每個樣品管中加入2 mL去離子水，與過量的衍生化試劑反應，稍加振蕩，靜置分層，吸取上層溶液，過膜，待測。

1.4 儀器條件 氣相色譜柱：HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)；進樣口溫度：250℃，檢測器溫度：250℃；柱溫：采用程序升溫，初始溫度120℃，保持0.5 min，以40℃/ min的升溫速率上升到180℃，保持0.5 min，以30℃/min的升溫速率上升到280℃，保持5 min；載氣：高純氮(純度99.999%)，流速1.8 mL/min，尾吹 20 mL/min；進樣量：1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方式和提取時間的優(yōu)化 為了減少操作步驟和提高樣品提取效率，以滿足大量樣品分析檢測的要求，本實驗采用振蕩和超聲提取2種方式比較，在空白樣品中添加0.2 mg/kg，3個重復。試驗了在振蕩條件下，提取1、2、8、12、24 h等5個時間段進行振蕩比較，結(jié)果表明，振蕩提取2 h的提取效率即能滿足要求；在超聲波振蕩條件下，提取10、15、20、30、60 min等進行提取比較，發(fā)現(xiàn)15 min提取效率即能滿足要求。所以，建議根據(jù)各自實驗室條件選擇振蕩2 h 或者超聲15 min均能滿足方法要求。具體結(jié)果(表1)。

表1 提取方式和提取時間的回收率結(jié)果比較

2.2 樣品衍生化的關鍵 由于提取劑是用乙腈/水混合提取，提取劑中含有水，所以必須要充分吹干或者充分晾干，否則衍生試劑將優(yōu)先和水分反應，而不能和DON正常衍生化反應。試驗表明，如果提取劑中水分沒有吹干，加入衍生試劑時，會有放熱反應，并發(fā)出“吱吱”的聲音，此時DON不能正常發(fā)生衍生反應，DON衍生產(chǎn)物幾乎檢測不出 。

2.3 色譜條件的優(yōu)化 試驗從環(huán)保、精簡前處理目的出發(fā)，所以對色譜條件的設置就較嚴格，需要將雜質(zhì)與標樣進行分離，本文通過調(diào)節(jié)氮氣流速、柱子起始溫度、程序升溫等條件，將雜質(zhì)和標樣較好的分離及標樣較快的出峰，經(jīng)過HP-5毛細管色譜柱分離，空白樣品、標樣和添加回收率的譜圖(圖1～3)，保留時間為6.19 min。

圖1 DON標準品衍生產(chǎn)物氣相色譜圖-0.1mg/L

圖2 小麥粉空白樣品衍生后氣相色譜圖

圖3 DON標準品添加回收柱前衍生產(chǎn)物氣相色譜圖-0.2mg/L

2.4 方法的線性范圍及檢出限 在優(yōu)化的實驗條件下，用甲醇將20 mg/L的DON標準儲備液，分別稀釋成0.01、0.025、0.1、0.25、0.5、1.0 mg/L 6個不同質(zhì)量濃度的標準溶液，搖勻，衍生化處理后，按照1.4儀器檢測條件，以峰面積對進樣絕對量做標準曲線，檢測線性范圍為0.01 ～1 ng，得到線性回歸方程為y=55 578x-797.5，相關系數(shù)R=0.998 5 。在上述條件下，DON的最小檢出量為0.01 ng。根據(jù)添加回收率實驗，在上述色譜條件下DON在小麥粉中的最低檢測濃度為0.01 mg/kg。

2.5 添加回收率和方法的精密度 在空白小麥粉中添加DON標準溶液，添加水平分別為0.04、 0.2、 1.0 mg/kg，每個水平6次重復，按上述方法進行提取、衍生化和測定。結(jié)果(表2)表明：在0.04～1.0 mg/kg添加水平下，DON的平均回收率在93.8%～108.5%，相對標準偏差為4.3%～8.6%，準確度和精密度符合分析要求。

表2 DON在小麥粉中添加回收率及相對標準偏差

2.6 定量結(jié)果計算 樣品中被測毒素含量以質(zhì)量分數(shù)ω計，單位mg/kg，按以下公式計算。

ρ——標準溶液中毒素的質(zhì)量濃度，mg/L；

A——樣品溶液中被測毒素的峰面積；

AS——毒素標準溶液中被測毒素的峰面積；

V1——提取溶劑總體積，mL；

V2——吸取出用于檢測的提取溶液的體積，mL；

V3——加入異辛烷的體積(相當于定容體積)，mL；

m——試樣的質(zhì)量，g；

計算結(jié)果保留2位有效數(shù)字，當結(jié)果>1 mg/kg時保留3位有效數(shù)字。

2.7 實際樣品測定與討論 用上述建立的方法對11個面粉樣品(市場購買)和10個小麥粒(取10個不同田塊，田間采集無病害癥狀)樣品進行了檢測，其中市售的面粉中DON含量為<0.01～0.92mg/kg，污染率為90.9%，超標率為0。小麥粒中DON含量為0.53～3.32mg/kg，污染率為100%，超標率為50%。從檢測結(jié)果可以看出，面粉中DON含量明顯低于小麥粒中的DON含量，有可能是小麥粒經(jīng)過市場進一步加工后，隨著表面麥麩層的去除，在小麥籽粒中赤霉毒素DON也能進一步去除、減少。查詢到文獻，小麥經(jīng)磨粉加工后，粗麩皮中DON含量達小麥籽粒的1.2～2.2倍，細麩皮中的毒素含量稍低于粗麩皮。因此從畜牧喂養(yǎng)安全來說，飼料的脫毒也是必要的一項措施。可以采取不同的方法進行脫毒處理如物理脫毒法、化學脫毒法、酶解法等[26-28]。

同時有文獻[29]指出，乳酸菌對DON有清除作用，其作用機制是物理吸附，而非降解為其他代謝物。戊糖乳桿菌Lp23130、鼠李糖乳桿菌Lr23119和戊糖片球菌Pp23190對液體環(huán)境中DON的吸附率都達到了80%以上，脫毒效果明顯。熱處理及酸處理能夠顯著提高乳酸菌對DON的吸附能力。因此對小麥種子采取必要的脫毒處理，也是減輕赤霉病病害、提高小麥籽粒的商品品質(zhì)，保證食品安全具有十分重要的意義。

DON既能引起人畜急性中毒也會造成慢性損害，所以加強對糧食中DON毒素的日常檢測與監(jiān)管是非常必要的，如監(jiān)管中一旦發(fā)現(xiàn)小麥超標樣品，則需盡快進行脫毒處理，再流入市場中。

3 結(jié)論

本文采用柱前衍生——氣相色譜儀技術建立了分析小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素含量的快速檢測方法。樣品經(jīng)提取衍生化后無需凈化，優(yōu)化了樣品前處理的時間。該方法簡便、快速、準確、穩(wěn)定、靈敏度高，普通適合于基層檢測機構(gòu)開展批量小麥粉(面粉)中DON含量的快速檢測。本研究將為DON在小麥作物上的安全性評價提供檢測依據(jù),也為DON在其他農(nóng)作物(農(nóng)產(chǎn)品)中殘留檢測提供一定的參考價值。本研究檢測結(jié)果同時也說明很多看似健康的小麥籽粒，很可能被毒素侵染，有些含量甚至超過1mg/kg的國家標準，所以為保證食品安全，人畜安全，從經(jīng)濟、安全角度考慮，如何對采收后的小麥粒進行毒素含量的日常監(jiān)管和市售之前必要的脫毒處理值得思考！