農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)的評(píng)價(jià)與判定

李國(guó)平，宋俊華，張宏軍，吳進(jìn)龍，陳鐵春

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

對(duì)農(nóng)藥的安全性評(píng)價(jià)，除了有效成分之外，原藥和制劑產(chǎn)品中的雜質(zhì)也是重要的因素，尤其是相關(guān)有害雜質(zhì)的判定和分析。建立相關(guān)雜質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)不僅直接關(guān)乎農(nóng)藥產(chǎn)品的使用效果，并且對(duì)人體健康、環(huán)境安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全產(chǎn)生重要影響，農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)管理已成為各國(guó)農(nóng)藥登記管理的重要內(nèi)容。

1 相關(guān)雜質(zhì)的概念

農(nóng)藥原藥中的雜質(zhì)主要是合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物、殘留的原材料、儲(chǔ)存過程中的分解產(chǎn)物和原材料帶入的雜質(zhì)。農(nóng)藥制劑中的雜質(zhì)則主要來源于加工使用的原藥和助劑或者加工或貯存過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。

當(dāng)雜質(zhì)與其所相關(guān)的有效成分相比，對(duì)人類和環(huán)境具有明顯毒害、對(duì)施用作物產(chǎn)生藥害、引起農(nóng)產(chǎn)品污染、影響農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性或引起其他不良影響，則該雜質(zhì)稱作相關(guān)雜質(zhì)，即雜質(zhì)的相關(guān)性和其與有效成分的相對(duì)危害有關(guān)。因此，在兩個(gè)不同有效成分中存在的同一雜質(zhì)，可能分別定義為相關(guān)和非相關(guān)，或在不同的有效成分中適用不同的最大允許限量。另外，雜質(zhì)的相關(guān)性不僅由所產(chǎn)生的危害確定，如果在實(shí)際使用過程中有證據(jù)表明其沒有顯著危害的可能，則一個(gè)潛在相關(guān)雜質(zhì)也可被定義為非相關(guān)雜質(zhì)。

2 雜質(zhì)相關(guān)性的判定

雜質(zhì)相關(guān)性的判定是對(duì)實(shí)際情況進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)做出的結(jié)果。在缺乏數(shù)據(jù)或相關(guān)信息進(jìn)行更精準(zhǔn)評(píng)價(jià)的情況下，F(xiàn)AO/WHO農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)席會(huì)議(JMPS)通常默認(rèn)采用全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度(GHS)對(duì)于混合物的分類標(biāo)準(zhǔn)。如，對(duì)于皮膚和眼刺激物設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為10 g/kg，對(duì)于具致敏性、致突變性、致癌和生殖毒性的化合物為1 g/kg。GHS承認(rèn)在一些情況下對(duì)準(zhǔn)則有所偏離是必要的或合理的。如果有數(shù)據(jù)支撐，JMPS將優(yōu)先評(píng)估得出最大可接受限量，即對(duì)整體危害構(gòu)成的影響可忽略時(shí)的劑量濃度，而不是采用GHS的限量。作為默認(rèn)的方法，當(dāng)原藥產(chǎn)品中的雜質(zhì)含量≥最大可接受濃度的10%，即為相關(guān)雜質(zhì)。因此對(duì)于皮膚和眼睛刺激物，當(dāng)含量達(dá)到1 g/kg時(shí)即為相關(guān)雜質(zhì)，對(duì)于具致敏性、致突變性、致癌和生殖毒性的化合物則為0.1 g/kg。

對(duì)于有器官毒性的化合物(如通過LD50、LOAEL、NOAEL、BMD、BMDL、ADI等進(jìn)行定義的)，通過計(jì)算得出最大可接受濃度，超過其10%即有相關(guān)性。

2.1 最大可接受濃度法 對(duì)于與有效成分相比，毒性危害相似(加和效應(yīng))的雜質(zhì)，JMPS采納的最大可接受濃度即為導(dǎo)致有效成分整體危害增加10%時(shí)的含量。同樣，10%的臨界值也適用于有效成分和雜質(zhì)的相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)都已知，可以對(duì)適宜的ADI/ARfD值進(jìn)行比較。用10%作為臨界值可能比較隨意，但可認(rèn)為其代表了增加的危害可忽略時(shí)的情況。如果缺少可用于進(jìn)行比較的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，最大可接受限量將視情況而定。

在評(píng)價(jià)與有效成分有“加和效應(yīng)”的雜質(zhì)的相關(guān)性時(shí)，JMPS使用“劑量-加和”模式，該模式可以表示為：

(1)

其中Cai和Cimp是活性成分和雜質(zhì)的濃度，TOXai、TOXimp和TOXTC是活性成分、雜質(zhì)和原藥(TC)的毒性。應(yīng)當(dāng)指出的是，TOXai值通常是不存在的，TOXTC代表所評(píng)估的具體原藥的值。

如前所述，毒性增加的最大可接受值是10%，10%的毒性增加被認(rèn)為是可以忽略的。在不存在其他毒的雜質(zhì)情況下，可以從公式(1)推導(dǎo)出:

(2)

從而推導(dǎo)出：

其中Cimpmax值為雜質(zhì)的最大可接受濃度。如果有超過一種相關(guān)雜質(zhì)，則可以使用不同雜質(zhì)的相對(duì)毒性來計(jì)算可接受的雜質(zhì)的總量。如果雜質(zhì)的實(shí)際最高濃度(生產(chǎn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn))<上述計(jì)算的Cimpmax值的10%，則通常認(rèn)為該TC的雜質(zhì)不相關(guān)。

例1：某原藥的急性口服LD50是1 000 mg/kg bw，雜質(zhì)的是100 mg/kg bw。TC的最小純度為920 g/ kg，由五批次全組分分析支持的雜質(zhì)的生產(chǎn)質(zhì)量控制極限為2 g/kg。

因此，雜質(zhì)濃度可接受的最大限度是10 g/kg。相對(duì)于920 g/kg的TC最小純度，10 g/kg的雜質(zhì)濃度是可能的。此外，生產(chǎn)質(zhì)控極限2 g/kg超過最大可接受極限10 g/kg的10%，因此雜質(zhì)是相關(guān)的。

例2：某生物農(nóng)藥的最低純度200 g/kg。一種雜質(zhì)的急性口服LD50為2 000 mg/kg bw，活性成分為1 000 mg/kg bw。也就是說，雜質(zhì)比活性成分的危害小。由五批次全組分分析支持的雜質(zhì)生產(chǎn)質(zhì)控限值為20 g/kg。

因此，雜質(zhì)濃度可接受的最大限度是200 g/kg。用200 g/kg的TC最小純度，可以達(dá)到200 g/kg的雜質(zhì)濃度。生產(chǎn)質(zhì)控限值20 g/kg=最大可接受限度的10%，因此雜質(zhì)是相關(guān)的。

例3：某原藥的急性口服LD50是600 mg/kg bw，某個(gè)雜質(zhì)的是400 mg/kg。TC的最小純度為980 g/kg，由五批次全組分分析支持的生產(chǎn)質(zhì)控限制為5 g/kg。

修約至1位有效數(shù)字(7×10)，雜質(zhì)濃度可接受的最大限度為70 g/kg。相對(duì)于980 g/ kg的TC最小純度，70 g/kg的雜質(zhì)濃度是不可能的。此外，生產(chǎn)質(zhì)控極限5 g/kg<最大可接受極限70 g/kg的10%，雜質(zhì)是不相關(guān)的。

需要指出的是“劑量-加和”模式不適用于致癌性、致突變性、致畸性，或眼睛和皮膚刺激性、以及致敏性等終點(diǎn)數(shù)據(jù)。對(duì)于這些終點(diǎn)數(shù)據(jù)，默認(rèn)的方法是使用GHS對(duì)于混合物的分類準(zhǔn)則。

2.2 未達(dá)定量水平雜質(zhì)相關(guān)性的評(píng)估 如果生產(chǎn)、儲(chǔ)存過程，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)理論推斷有可能存在相關(guān)性的雜質(zhì)，但由于方法檢出限等技術(shù)原因未檢出或未達(dá)到定量限時(shí)，應(yīng)按下述原則評(píng)價(jià)和判定。

2.2.1 雜質(zhì)偶爾出現(xiàn)在實(shí)際生產(chǎn)批次產(chǎn)品中，但混合批次產(chǎn)品中未達(dá)定量水平，則采用混合前量值按照上述2.1程序評(píng)估雜質(zhì)危害程度。

2.2.2 有證據(jù)或經(jīng)驗(yàn)表明，在有效成分生產(chǎn)中可能產(chǎn)生雜質(zhì)，但出現(xiàn)下述(1)、(2)、(3)的情況時(shí)，則可認(rèn)定為非相關(guān)雜質(zhì)，但應(yīng)在產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中注明。

(1)在評(píng)估產(chǎn)品中從未達(dá)到檢出水平；

(2)采用的工藝不可能產(chǎn)生該雜質(zhì)；

(3)雜質(zhì)可能來源于生產(chǎn)的起始原料，但經(jīng)評(píng)估，申請(qǐng)產(chǎn)品的生產(chǎn)商實(shí)際使用的原料中不會(huì)出現(xiàn)。

2.3 遵從國(guó)家農(nóng)藥管理規(guī)定 有些雜質(zhì)已被國(guó)家農(nóng)藥管理機(jī)構(gòu)或相關(guān)國(guó)際組織根據(jù)已有的科學(xué)數(shù)據(jù)確定為潛在的相關(guān)雜質(zhì)，它們有致畸、致癌、神經(jīng)毒劑、生殖毒性，如：苯胺和取代苯胺類，硫酸二甲酯類，二氯聯(lián)苯三氯乙烷(DDT)類，乙撐硫脲(ETU)和丙烯硫脲(PTU)類，鹵代二苯并二噁英類，鹵代二苯并呋喃類，肼和取代肼類，亞硝胺類，有機(jī)磷酸酯氧化物類，四乙基硫代二磷酸鹽(治螟磷)類，有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯的亞砜和砜化物類，氯化偶氮苯類，甲基異氰酸酯類，多氯代聯(lián)苯(PCBs)和六氯苯(HCB)類，苯酚類等。對(duì)這些類雜質(zhì)，若根據(jù)科學(xué)和經(jīng)驗(yàn)推斷產(chǎn)品中有可能存在時(shí)，均需進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3 相關(guān)雜質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)

如果在實(shí)際的生產(chǎn)工藝中，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)限量低于可接受限量，JMPS通常將優(yōu)先采用標(biāo)準(zhǔn)限量。

標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)雜質(zhì)限量標(biāo)準(zhǔn)的最大值采用有效成分含量的 g/kg來表示。個(gè)別情況下，當(dāng)有證據(jù)表明相關(guān)雜質(zhì)的濃度與有效成分加工、稀釋等影響相關(guān)聯(lián)時(shí)，該最大值可采用制劑產(chǎn)品的 g/kg來表示。規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)中要分別對(duì)每種相關(guān)雜質(zhì)規(guī)定不同的條款。相關(guān)雜質(zhì)的檢測(cè)平均值不能超出限量規(guī)定的最大值。分以下3種情況：

(1)≥1 g/kg的相關(guān)雜質(zhì)，限量標(biāo)準(zhǔn)參照全組分分析報(bào)告(至少5個(gè)有 代表性的批次)中研究確定的結(jié)果(目前要求提供GLP五批次全組分分析報(bào)告)制定，申請(qǐng)者應(yīng)對(duì)制定依據(jù)給出明確解釋(例如，在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的最高劑量，或?qū)嶋H生產(chǎn)中所測(cè)平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差等)。相關(guān)雜質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)一般用五批次全組分分析報(bào)告研究結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

如使用同一工藝在1個(gè)以上地方生產(chǎn)，應(yīng)提供至少2個(gè)生產(chǎn)點(diǎn)的五批次全組分分析報(bào)告，且反應(yīng)了典型極端情況下的雜質(zhì)數(shù)據(jù)。

(2)含量<1 g/kg的相關(guān)雜質(zhì)，限量標(biāo)準(zhǔn)同樣參照全組分分析報(bào)告(至少5個(gè)有代表性的批次)中研究確定的結(jié)果(目前要求提供GLP五批次全組分分析報(bào)告)制定，申請(qǐng)者也需給出制定依據(jù)。

(3)對(duì)觀察到的相關(guān)雜質(zhì)的毒副作用給出解釋，如毒理學(xué)效應(yīng)、對(duì)有效成分穩(wěn)定性的影響等。JMPR或注冊(cè)機(jī)構(gòu)制定的限量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該附有上述解釋，以示對(duì)限量標(biāo)準(zhǔn)制定的權(quán)威性。

4 相關(guān)雜質(zhì)分析與分析方法驗(yàn)證

我國(guó)及FAO/WHO等國(guó)家和組織要求，在制定農(nóng)藥產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，必須同時(shí)建立一套具有可操作性、符合相關(guān)雜質(zhì)限量檢測(cè)要求的、與農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)測(cè)系統(tǒng)及生產(chǎn)相適應(yīng)的雜質(zhì)定性定量分析方法。相關(guān)雜質(zhì)的分析方法至少應(yīng)經(jīng)過等效性確認(rèn)，若還沒有已公布的分析方法和方法等效性確認(rèn)資料，則申請(qǐng)人應(yīng)向注冊(cè)機(jī)構(gòu)提交這些資料。

4.1 相關(guān)雜質(zhì)的定性分析 我國(guó)要求申請(qǐng)者在提交的原藥全組分分析報(bào)告中，提供原藥中雜質(zhì)紅外光譜、核磁共振譜和質(zhì)譜中至少1種定性試驗(yàn)方法及色譜保留時(shí)間、解析過程、結(jié)構(gòu)式、通用名稱或化學(xué)名稱及相關(guān)譜圖。

4.2 相關(guān)雜質(zhì)的定量分析

4.2.1 定量分析方法

4.2.1.1 應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照定量法，分析方法應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)。

4.2.1.2 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)際農(nóng)藥分析協(xié)作委員會(huì)(CIPAC)等國(guó)際通用方法的，僅需進(jìn)行部分方法確認(rèn)。方法確認(rèn)包括線性關(guān)系、精密度和定量限等。4.2.1.3 對(duì)于實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)的方法，應(yīng)進(jìn)行方法確認(rèn)。方法確認(rèn)包括特異性、線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限和定量限等。

4.2.2 定量分析方法確認(rèn)

4.2.2.1 特異性 特異性可通過與另一種已證明是合適的、分離或檢測(cè)原理不同、或具有較強(qiáng)分辨能力的方法進(jìn)行結(jié)果比較來確定。通?？墒褂脷庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MS)或者二極管陣列檢測(cè)器(DAD)進(jìn)行測(cè)定，確認(rèn)其特異性。

4.2.2.2 線性關(guān)系 被測(cè)相關(guān)雜質(zhì)響應(yīng)的線性范圍，至少應(yīng)≥其標(biāo)準(zhǔn)限量標(biāo)明濃度的±20%。至少測(cè)定3個(gè)濃度，每個(gè)濃度測(cè)定2次，應(yīng)附上線性關(guān)系圖、斜率、截距和相關(guān)系數(shù)等數(shù)據(jù)。測(cè)得的斜率可證明響應(yīng)與分析物濃度之間有明顯的相關(guān)性。在標(biāo)明值±20%范圍內(nèi)，其結(jié)果不應(yīng)與線性有顯著偏離，一般相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)>0.99，否則需提供如何保證方法有效性的說明。如由于特殊需要使用不成線性響應(yīng)的方法，必須做出解釋。

4.2.2.3 精密度 精密度可用重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行考察。重復(fù)性試驗(yàn)需至少進(jìn)行5次樣品的平行測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用RSDr表示。

要求：RSDr<2(1-0.5 1ogC)×0.67

式中：C為樣品中待測(cè)物濃度，以小數(shù)計(jì)(如待測(cè)物濃度為20%，C=0.2)。

對(duì)于測(cè)定結(jié)果中的偏離數(shù)據(jù)，可用Dixon法或Grubbs法檢驗(yàn)，但要舍去某些結(jié)果時(shí)，必須明確指出，并應(yīng)解釋產(chǎn)生偏離的原因。

4.2.2.4 準(zhǔn)確度 評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度，可采用添加回收率試驗(yàn)，即在已知被測(cè)組分含量的樣品中精確加入一定量的被測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)品，再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。加標(biāo)后被測(cè)組分濃度應(yīng)在線性范圍內(nèi)。

回收率=(測(cè)得量-原有量)/加入量×100%

進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限量指標(biāo)水平上，至少進(jìn)行2個(gè)添加回收試驗(yàn)?？梢耘渲婆c待測(cè)組分含量測(cè)定時(shí)濃度相同的5份樣品(樣品取樣量減半，按1:1比例加入標(biāo)準(zhǔn)品)，也可以配制3個(gè)不同濃度的樣品(樣品取樣量減半，按0.8:1、1:1、1.2:1比例加入標(biāo)準(zhǔn)品)，每個(gè)濃度平行做2份，共6份。

添加回收率應(yīng)符合下列要求：

相關(guān)雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限量濃度(%)添加回收率(%)> 190～1100.1～180～120<0.175～125

4.2.2.5 靈敏度 靈敏度可用檢出限(LOD)和定量限(LOQ)評(píng)價(jià)。分析方法的檢出限是指樣品中被測(cè)組分能被檢出的最低量，但并不要求可定量檢測(cè)，一般用信噪比為3時(shí)物質(zhì)的量或濃度來表示。分析方法的定量限是指樣品中的被測(cè)組分在適當(dāng)?shù)木芏群蜏?zhǔn)確度下可準(zhǔn)確進(jìn)行定量檢測(cè)的最低量或濃度，是低含量組分如雜質(zhì)或降解物定量分析中的重要參數(shù)，一般用信噪比為10時(shí)物質(zhì)的量或濃度來表示。在進(jìn)行低含量相關(guān)雜質(zhì)組分分析時(shí)，定量限需要低于規(guī)定限量，以便能夠測(cè)定可能存在于樣品中的痕量雜質(zhì)，通常在1/10～1/2之間。

5 小結(jié)

世界各國(guó)日益重視農(nóng)藥的生態(tài)安全和環(huán)境保護(hù)，逐步加強(qiáng)農(nóng)藥管理方面的立法，更加重視農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。近年來，F(xiàn)AO/WHO、歐盟、澳大利亞等國(guó)際組織和國(guó)家對(duì)農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)的管理要求不斷提高，分別對(duì)農(nóng)藥原藥的雜質(zhì)限量進(jìn)行了規(guī)定。

2017年我國(guó)新修訂的《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》及配套規(guī)章陸續(xù)頒布實(shí)施，農(nóng)藥具有毒理學(xué)意義的相關(guān)雜質(zhì)的評(píng)價(jià)與判定，對(duì)我國(guó)農(nóng)藥登記資料的技術(shù)審查至關(guān)重要。借鑒和參考FAO/WHO及發(fā)達(dá)國(guó)家關(guān)于農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)的管理，對(duì)于提高我國(guó)農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)的科學(xué)管理水平具有重要的意義。