p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體在小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后的表達(dá)變化特點

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(1 臨沂市人民醫(yī)院，山東 臨沂 276003；2 山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(Neurotrophin receptor，NTR)作為腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。神經(jīng)營養(yǎng)素與p75NTR結(jié)合，可以調(diào)控不同的信號通路，介導(dǎo)細(xì)胞的存活、分化、生長和凋亡[1-2]。p75NTR生物學(xué)功能取決于配體的生物學(xué)特性、與配體結(jié)合后的相互作用、蛋白水解處理過程和激動的信號傳導(dǎo)途徑等因素[3]。在周圍神經(jīng)損傷時，p75NTR表達(dá)與神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)有著密切的關(guān)系。目前，對于周圍神經(jīng)損傷后p75NTR表達(dá)變化特點尚不清楚，本研究通過觀察小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后不同時間點p75NTR表達(dá)水平，以探討其表達(dá)變化特點。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 選取野生型健康雄性C57BL/6小鼠42只，8～10周齡，體重22～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，許可證號SCXK (京) 2012-0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為層流環(huán)境，保持環(huán)境溫度在22～24 ℃，相對濕度在50%～60%，光控周期12 h，給光時間7:00-19:00。將實驗小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組及模型組，各21只。模型組根據(jù)成模時間分為成模前、成模后0、3、7、14、21、28 d等7個時間點，每個時間點各3只。

1.2主要實驗試劑 異氟烷(上海雅培制藥有限公司)；TRIzol(Invitrogen，美國)；PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 實時熒光定量試劑盒(TaKaRa，日本)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物公司)；Anti-GAPDH抗體、兔抗鼠p75NTR抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(abcam，美國)。氯仿、異丙醇及無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.3動物模型制備 實驗小鼠采用異氟烷吸入麻醉(2%異氟烷+98%氧)，按照文獻(xiàn)[4]報道使用鉗夾法制作小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷模型。麻醉成功后，備皮、常規(guī)碘伏消毒，小鼠俯臥于手術(shù)臺上，在左側(cè)臀部作長約2 cm斜切口，鈍性分離坐骨神經(jīng)，使用全新顯微光滑血管鉗(Fine Science Tools，型號13006-12)在坐骨結(jié)節(jié)遠(yuǎn)端5 mm處鉗夾坐骨神經(jīng)，定量壓1扣，持續(xù)時間60 s。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)，無坐骨神經(jīng)鉗夾，其余同模型組。術(shù)后小鼠分籠喂養(yǎng)。實驗過程中對動物處置嚴(yán)格遵守科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物指導(dǎo)性意見》要求。

1.4標(biāo)本采集與處理 在成模前、成模0、3、7、14、21、28 d等7個時間點隨機(jī)取假手術(shù)組和模型組小鼠各3只，在深麻醉狀態(tài)下，將小鼠俯臥于手術(shù)臺上，暴露坐骨神經(jīng)，取坐骨神經(jīng)損傷部位近端2 mm處到損傷部位遠(yuǎn)端2 mm處標(biāo)本，置于-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1p75NTRmRNA表達(dá)的檢測 用 TRIzol 法提取坐骨神經(jīng)組織總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度及純度。使用 PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s。采用SYBR實時熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，PCR引物序列見表1。使用the Step One Plus定量 PCR 儀擴(kuò)增和檢測，反應(yīng)條件 95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個擴(kuò)增循環(huán)，內(nèi)參為GADPH，使用2-ΔΔCt方法對p75NTRmRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增目的DNA片段長度

1.5.2p75NTR蛋白表達(dá)的檢測 使用RIPA裂解液將坐骨神經(jīng)組充分裂解，BCA法對蛋白定量。取 50 μg蛋白樣本與蛋白上樣緩沖液按比例混勻，100 ℃水浴5 min；SDS-PAGE蛋白電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；兔抗p75NTR抗體(1:500)和鼠抗Anti-GAPDH抗體(1:2000)4 ℃ 孵育過夜；加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG/山羊抗鼠IgG(1:4000)，室溫下孵育2 h；ECL 化學(xué)發(fā)光、顯影，使用Image Pro Plus 軟件分析條帶灰度值，GADPH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1兩組p75NTRmRNA表達(dá)的比較 成模前假手術(shù)組與模型組p75NTRmRNA表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，在成模第3天模型組p75NTRmRNA表達(dá)升高，與成模前比較有顯著性差異(P<0.01)；模型組p75NTRmRNA表達(dá)在成模第7天達(dá)峰值，在成模第3、7、14天 p75NTRmRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組(P<0.01)，在成模第21天降至成模前水平(P>0.05)；假手術(shù)組(圖中Sham組)在各個時間點p75NTRmRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 RT-qPCR檢測坐骨神經(jīng)擠壓損傷部位p75NTR mRNA相對表達(dá)量

2.2兩組p75NTR蛋白表達(dá)的比較 成模前兩組p75NTR蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)，在成模第3天模型組p75NTR蛋白表達(dá)水平開始升高，與成模前比較有顯著性差異(P<0.01)；在成模第14天模型組p75NTR蛋白表達(dá)水平達(dá)峰值，在成模第3、7、14及21天模型組p75NTR蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組(P<0.01)，在成模第28天降至成模前水平(P>0.05)；假手術(shù)組在各個時間點p75NTR蛋白表達(dá)水平比較無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

3 討論

p75NTR與神經(jīng)營養(yǎng)素結(jié)合，可以對神經(jīng)再生發(fā)揮雙向生物學(xué)調(diào)節(jié)作用[5]。正常情況下中樞和外周神經(jīng)p75NTR處于低表達(dá)狀態(tài)，而在多種損傷作用下p75NTR的表達(dá)明顯上調(diào)[6-7]。在周圍神經(jīng)損傷后，損傷遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維發(fā)生華勒氏變性，軸突的缺失可誘導(dǎo)施萬細(xì)胞中p75NTR表達(dá)，而p75NTR表達(dá)上調(diào)參與軸突再髓鞘化。在神經(jīng)損傷修復(fù)不同時期p75NTR表達(dá)狀態(tài)會對神經(jīng)再生有不同的影響作用。因此，明確周圍神經(jīng)損傷后p75NTR表達(dá)變化特點對進(jìn)一步探討p75NTR對損傷神經(jīng)的再生作用及調(diào)節(jié)機(jī)制十分重要。

圖2 Westernblot檢測坐骨神經(jīng)擠壓損傷部位p75NTR 蛋白表達(dá)量

本研究表明，在坐骨神經(jīng)擠壓傷后p75NTRmRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量與坐骨神經(jīng)損傷后時間有關(guān)。在傷后第3天神經(jīng)損傷部位p75NTRmRNA表達(dá)開始升高，第7天達(dá)到高峰，第21天降至成模前水平；而p75NTR蛋白表達(dá)在傷后第3天開始升高，第14天達(dá)到高峰，第28天降至成模前水平。筆者發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果中p75NTRmRNA和蛋白表達(dá)峰值不一致，其可能原因與神經(jīng)損傷后不同的調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白存在合成及降解的差異[8]，即mRNA達(dá)到峰值時蛋白表達(dá)還在增加，而在蛋白達(dá)到峰值時mRNA已經(jīng)降解，從而導(dǎo)致p75NTRmRNA和蛋白表達(dá)水平并不完全一致。既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)擠壓傷小鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)在術(shù)后第10天降至谷值，然后SFI逐漸升高，在損傷后2～3周神經(jīng)功能恢復(fù)最快，持續(xù)至術(shù)后4周，說明坐骨神經(jīng)擠壓傷后神經(jīng)功能恢復(fù)也存在相似的時間相關(guān)性。筆者推測p75NTR蛋白可能參與調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)擠壓傷后神經(jīng)再生。

綜上所述，在小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后p75NTR表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與損傷后時間密切相關(guān)，p75NTR表達(dá)的時序性特點可能與損傷神經(jīng)再生修復(fù)有關(guān)，為進(jìn)一步探討p75NTR在坐骨神經(jīng)擠壓傷后神經(jīng)再生的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。