兩種肉及肉制品聯(lián)合檢測試劑盒的質(zhì)量評價

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710048）

肉及肉制品的摻假問題是長期以來一直存在的問題，如在售價較高的牛羊肉中摻入價格低廉的豬肉，甚至鴨肉、雞肉等，且摻假者造假手段越來越高明，一般的感官檢驗難以區(qū)分，因此對肉品的種屬進行鑒定是當(dāng)前食品安全檢測研究的方向之一。目前，對于摻假肉鑒別方法主要有紅外光譜分析法、色譜法、質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法和分子生物學(xué)方法[1]，其中以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法是當(dāng)前研究的熱點。

本文中進行質(zhì)量評價的聯(lián)合檢測試劑盒，是根據(jù)動物種間線粒體基因的多態(tài)性差異，分別設(shè)計特異性引物，利用實時熒光PCR聯(lián)合檢測方法，在一個PCR反應(yīng)體系內(nèi)同時對多個物種的特異性片段進行擴增，通過加入熒光染料SYBR來檢測熒光信號，最后通過擴增的Ct值與對照內(nèi)參的Ct值來確定陰陽性，從而建立的一種能夠同時測定肉制品中多種動物源成分的實時熒光PCR聯(lián)合檢測方法。該方法可以同時對肉及肉制品中多種動物源性成分（豬、牛、羊、雞、鴨、鵝；驢、馬、狗、兔、貓、鼠等）的單一肉制品或多種動物的混合肉制品進行檢測鑒定，能夠檢測到的摻假比例為1%[2]。本文通過該試劑盒對本實驗室保存的肉和市售肉及肉制品的檢測，證實對于不同加工處理的肉制品，所設(shè)計的聯(lián)合檢測試劑盒均可準(zhǔn)確檢測目的種源肉。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

①儀器：ABI 7500型實時熒光PCR擴增儀，美國Life公司；旋渦混合器，海門市其林爾儀器制造公司；數(shù)顯電熱恒溫水浴箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。②試劑：組織DNA提取試劑盒，DEAOU公司；肉及肉制品聯(lián)合檢測試劑盒，陜西瑞奇生物科技有限公司；試劑盒SR1，可區(qū)分豬、牛、羊、雞、鴨、鵝；試劑盒SR2，可區(qū)分驢、馬、狗、兔、貓、鼠。

1.2 樣本來源

本試驗所用的樣本來自于本實驗室在-18 ℃冷凍保存的已知動物種源成分的生肉，以及購買自本地各大型商超售賣的肉干制品、火腿、肉罐頭等肉制品，還有個別購買于早點攤的肉包。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本DNA提取

①對食品樣品進行均質(zhì)處理，將不同類型的樣品分開處理，防止不同動物種源食品的交叉污染。②按照組織基因組DNA提取試劑盒方法提取樣品DNA。根據(jù)樣本情況，取組織10～30 mg，加入230 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，55 ℃水浴消化2～3 h，離心取上清液，加入250 μL柱平衡液，70 ℃水浴1 min，加入250 μL無水乙醇，混勻后上DNA吸附柱，將DNA從吸附柱上洗脫下來，-20 ℃保存、備用。

1.3.2 實時熒光PCR聯(lián)合檢測的體系及反應(yīng)條件

實時熒光PCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL，其中酶反應(yīng)液10 μL、雙蒸水8 μL、檢測引物（不同動物種源引物或者內(nèi)參、陰性對照的引物）1 μL，10倍稀釋后的樣本模板DNA 1 μL或陰性對照1 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)，熔解曲線為 60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.3.3 結(jié)果判定

每個樣本同時用SR1試劑盒和SR2試劑盒進行檢測。判斷方法為：用擴增的樣本Ct值與內(nèi)參的Ct值比對，從而確定擴增樣本中是否含有特異引物對應(yīng)的動物種源。當(dāng)樣本擴增Ct值與內(nèi)參擴增的Ct值的差值的絕對值≥7時，則判定為陰性，即說明該樣本中未檢出特異引物對應(yīng)的動物源成分，當(dāng)樣本擴增Ct值與內(nèi)參擴增的Ct值的差值的絕對值＜7時，則判定為陽性，即說明該樣本中檢出特異引物對應(yīng)的動物源成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 對生肉制品的檢測結(jié)果

生肉樣本共計16份，對其分類，見表1。

表1 16個生肉樣本的不同分類表

使用該聯(lián)合檢測試劑盒對表1中生肉進行實時熒光PCR檢測，Ct值及判定結(jié)果見表2。檢測結(jié)果表明：通過該試劑盒檢出的16份生肉樣本中的動物種源成分均與已知動物種源相符。說明該聯(lián)合檢測試劑盒可準(zhǔn)確檢測生肉樣本的動物種源成分。

表2 兩種聯(lián)合檢測試劑盒對16個生肉樣本進行實時熒光PCR檢測的Ct值與動物種源判定結(jié)果表

2.2 對熟肉制品的檢測結(jié)果

熟肉樣本共計34份，對其分類，見表3。

表3 34個熟肉樣本的不同分類表

使用該聯(lián)合檢測試劑盒對表3中熟肉制品進行了實時熒光PCR檢測，Ct值及判定結(jié)果見表4。檢測結(jié)果表明：32份商超購買的樣本通過該試劑盒檢出的動物種源成分均與樣本標(biāo)簽標(biāo)注的動物種源相符。購自早點攤的兩個樣本，其中38號僅檢出豬源性成分，與樣本標(biāo)稱動物源成分相符合，而37號樣本不僅檢出樣本標(biāo)稱的牛源性成分，還檢出樣本未標(biāo)稱的豬源性成分，說明該樣本存在摻假問題。這34份熟肉制品的實時熒光PCR檢測分析結(jié)果表明：該聯(lián)合檢測試劑盒可準(zhǔn)確檢測熟肉制品的動物種源成分。

表4 兩種聯(lián)合檢測試劑盒對34個熟肉樣本進行實時熒光PCR檢測的Ct值及動物種源判定結(jié)果表

續(xù)表4

3 討論

針對肉制品中動物種源，該聯(lián)合檢測試劑盒不但可以檢測單一動物種源的肉，還可以同時檢測出混合肉中相應(yīng)的動物種源成分；不但能夠檢測未經(jīng)加熱處理的生肉及其制品，還能夠檢測經(jīng)過長時間高溫處理過的肉及肉制品的相應(yīng)的動物種源成分，對各物種的靈敏度為1%。

該試劑盒不用設(shè)計特異性探針，通過與內(nèi)參比對判定陰陽性，能夠排除因沾染而造成的假陽性結(jié)果，同時由于內(nèi)參和對照的存在，可以避免因為DNA的含量太少而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。

使用該試劑盒檢測時，樣本模板中DNA的最適濃度為50 ng/μL，該濃度下內(nèi)參的Ct值約在15[2]。由于本次驗證工作未進行所有樣本核酸濃度的檢測，僅檢測其中5個樣本的模板核酸濃度為100～1 000 ng/μL，在利用該試劑盒進行檢測時，對所有樣本模板進行10倍稀釋，即最終上機檢測的樣本模板的核酸濃度為10～100 ng/μL，結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)參的Ct值在8～12，樣本的Ct值在7～25這樣一個較寬的區(qū)間。但是，由于最終的判定依據(jù)是內(nèi)參的Ct值和樣本Ct值的差值，即使在這樣不完全確定核酸濃度的檢測條件下，仍能夠得到正確的檢測結(jié)果，說明該試劑盒對模板的核酸濃度不需要太嚴(yán)格的要求。

綜合分析，本研究驗證的實時熒光PCR聯(lián)合檢測試劑盒能一次擴增出多種不同種類肉品對應(yīng)的特異性DNA片段，可用于肉及肉制品動物源成分的真?zhèn)舞b別及摻假情況判定，特異性強，靈敏度高，操作簡便，基本可以滿足市場對肉及肉制品種源鑒別檢測的要求。