茶多酚對奧尼羅非魚生長、消化功能、免疫性能和抗病力的影響

梁高楊 李小勤 楊 航 POOLSAWAT Lumpan 高擘為 冷向軍*

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；3.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

抗生素的長期使用帶來的病原菌抗藥性和藥物殘留問題嚴重危害了水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展[10]，尋找安全有效的抗生素替代產(chǎn)品一直是水產(chǎn)研究的熱點。茶多酚具有廣泛的抗菌譜，能夠抑制多種病原菌的生長[11-12]，并且茶多酚能夠提高魚類的免疫性能[13-14]，是一種潛在的抗生素替代物。本試驗以奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)為研究對象，在飼料中添加不同水平的茶多酚，考察其對奧尼羅非魚生長、消化功能、免疫性能和抗嗜水氣單胞菌感染能力的影響，為茶多酚在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕為主要蛋白質源，豆油為主要脂肪源，配制基礎飼料(粗蛋白質含量32.06%，粗脂肪含量5.62%)。在基礎飼料中分別添加0(對照組)、100、200、400、600、800 mg/kg的茶多酚[14]，配制6種試驗飼料，另在飼料中加入0.05%氧化釔(Y2O3)，以測定營養(yǎng)物質表觀消化率。主要飼料原料粉碎后過40目篩，逐級混合，用單螺桿擠壓機(SLP-45，中國水產(chǎn)科學研究院漁業(yè)機械研究所)制成直徑2 mm的硬顆粒沉性飼料，制粒溫度為(85±5) ℃，55 ℃烘干后4 ℃冰箱保存?；A飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。茶多酚由山東豐泰生物科技有限公司提供，純度為98%。

1.2 試驗用魚及飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在上海海洋大學濱海特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場進行，養(yǎng)殖時間為9周。試驗用奧尼羅非魚購于上海新場羅非魚良種養(yǎng)殖場，于試驗開始前用對照組飼料馴養(yǎng)1周。選取450尾平均體重為(6.09±0.07) g的奧尼羅非魚，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復25尾魚，以重復為單位隨機分配到18口網(wǎng)箱(1.5 m×1.0 m×1.2 m)中，每6口網(wǎng)箱置于一口室內(nèi)水泥池(5.0 m×3.0 m×1.2 m)內(nèi)，共3口水泥池，位于同一室內(nèi)車間內(nèi)，水源均為過濾后的池塘水。試驗魚表觀飽食投喂，日投喂3次(08:00、12:00、17：00)。試驗期間，每周換水2次，每次換水1/3，水溫(28±2)℃，pH 7.5±0.5，溶氧濃度>6.0 mg/L，氨氮濃度<0.2 mg/L。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)飼料原料購自上海農(nóng)好飼料有限公司，其中魚粉(秘魯)、豆粕、菜籽粕、棉籽粕的粗蛋白質含量分別為65.18%、44.65%、36.64%、44.77%。The feed ingredients were purchased from theShanghaiNonghaoFeed Co., Ltd., and the crude protein content of fish meal (Peru), soybean meal, rapeseed meal and cottonseed meal was 65.18%, 44.65%, 36.64% and 44.77%, respectively.
2)維生素預混料為每千克飼料提供The vitamin premix provided the following per kg of the diet:VA 6 000 IU,VD31 000 IU,VE 60 IU,VK 5 mg,VB115 mg,VB215 mg,VB330 mg,VB535 mg,VB620 mg,生物素 biotin 2 mg,葉酸 folic acid 3 mg,VB120.03 mg。
3)礦物質預混料為每千克飼料提供The mineral premix provided the following per kg of the diet:Ca(IO3)20.04 g,CoCl2·6H2O 0.01 g,FeSO4·H2O 0.446 g,ZnSO4·H2O 0.232 g,MnSO4·H2O 0.063 g,NaSeO3·5H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.645 g。

1.3 樣品采樣和指標測定

1.3.1 生長指標

養(yǎng)殖試驗結束后，禁食24 h，記錄試驗魚尾數(shù)并稱重，用于計算生長指標；每口網(wǎng)箱隨機取3尾魚，測量體長，解剖取內(nèi)臟和肝臟，稱重用于計算形體指標。相關計算公式如下：

增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(終末均重-初始均重)/初始均重；飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=總攝食量/(終末均重-初始均重)；存活率(survival rate,SR,%)=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)；采食量(feed intake,FI,g)=總攝食量/魚尾數(shù)；肝體指數(shù)(hepatosomatic index,HSI,%)=100×肝臟重/體重；臟體指數(shù)(viscerosomatic index,VSI,%)=100×內(nèi)臟重/體重；肥滿度(condition factor,CF,g/cm3)=100×體重/體長3。

1.3.2 飼料和全魚常規(guī)成分分析

在魚體稱重之后，每口網(wǎng)箱隨機取3尾魚，用于全魚常規(guī)成分分析。飼料和全魚中水分含量的測定采用105 ℃烘干法，粗蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法(全自動凱氏定氮儀，Kjeltec-2300，福斯有限公司，瑞典)，粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法(脂肪測定儀，SOX-416，格哈特有限公司，德國)，粗灰分含量的測定采用550 ℃馬弗爐灼燒法(程控箱式電爐，SXL-1008，上海精宏實驗儀器有限公司)。

1.3.3 血清免疫指標的測定

每口網(wǎng)箱另隨機取3尾魚，尾靜脈取血，4 ℃離心(3 000 r/min，10 min)，取血清分裝后-80 ℃冰箱保存。血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、堿性磷酸酶(alkline phosphatase,AKP)、溶菌酶(lysozyme,LZM)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的生化試劑盒測定，按照試劑盒說明書進行操作。SOD和AKP活性使用酶標儀(Synergy 2，伯騰儀器有限公司，美國)測定；MDA含量和LZM活性使用分光光度計(722型，上海精密科學儀器有限公司)測定。

1.3.4 腸道消化酶活性的測定

將每口網(wǎng)箱抽血后的3尾魚在冰上解剖后取前腸(胃到腸道第1個彎曲點)，生理鹽水沖去食糜，-80 ℃冰箱保存。測定前，將前腸于4 ℃解凍，加9倍體積生理鹽水，冰水浴勻漿，4 ℃離心(3 000 r/min，10 min)，取上清用于消化酶活性的測定。

淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的生化試劑盒測定，組織中每毫克蛋白質在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活性單位。蛋白酶活性采用福林酚法測定，以2%酪蛋白溶液為底物，每微克組織蛋白質在pH 7.2、37 ℃條件下每分鐘分解酪蛋白生成1 μg酪氨酸的酶量為1個蛋白酶活性單位。腸道蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法。

1.3.5 營養(yǎng)物質表觀消化率測定

養(yǎng)殖試驗開始30 d后，在正常投喂的同時，連續(xù)10 d采集糞便，用于測定營養(yǎng)物質表觀消化率。每次于投喂2 h后，虹吸法收集糞便，取包膜完整、連續(xù)的糞便于60 ℃烘干，-20 ℃保存待測。飼料和糞便中Y2O3含量測定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(等離子體發(fā)射光譜儀，Optima 8000DV，帕金埃爾默股份有限公司，美國)，糞便中粗蛋白質含量測定同1.3.2中方法。

干物質表觀消化率(%)=100×(1-b/B)；粗蛋白質表觀消化率(%)=100×[1-(A/a)×(b/B)]。

式中：a、A分別表示飼料和糞便中粗蛋白質含量；b、B分別表示飼料和糞便中Y2O3含量。

1.3.6 嗜水氣單胞菌攻毒試驗

養(yǎng)殖試驗結束后，每個網(wǎng)箱取12尾魚，進行嗜水氣單胞菌攻毒試驗。攻毒所用嗜水氣單胞菌來自上海海洋大學國家水生動物病原庫(呂利群實驗室)。將菌種接種于營養(yǎng)瓊脂平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082，上海善志儀器設備有限公司)，純化培養(yǎng)24 h，挑取單克隆菌株于無菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)30 h，3 500 r/min離心5 min，去除上清，無菌生理鹽水稀釋至濃度為1.1×108CFU/mL。每尾試驗魚腹腔注射濃度為1.1×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌菌液0.2 mL(濃度和劑量根據(jù)預試驗確定)。記錄攻毒后1、24、48、96 h死亡個數(shù)，計算累積死亡率。

累積死亡率(cumulative mortality,CM,%)=100×累積死亡尾數(shù)/初始魚總尾數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)(存活率除外)用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時，用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 茶多酚對奧尼羅非魚生長和形體指標的影響

茶多酚對奧尼羅非魚生長和形體指標的影響見表2。經(jīng)過9周的養(yǎng)殖試驗，各組奧尼羅非魚的存活率均為100%，且在采食量上無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，各茶多酚添加組的增重率和飼料系數(shù)均無顯著變化(P>0.05)，但100和200 mg/kg茶多酚組增重率有提高的趨勢，而400、600和800 mg/kg茶多酚組增重率有降低的趨勢，且800 mg/kg茶多酚組的增重率較200 mg/kg茶多酚組顯著降低(P<0.05)。以增重率為評價指標，得出奧尼羅非魚增重率(y)與茶多酚添加量(x)之間的一元二次回歸方程為y=-0.000 3x2+0.122 4x+1 500(R2=0.508 4)，由回歸方程得出，當茶多酚添加量為204 mg/kg時，奧尼羅非魚具有最高的增重率。在形體指標方面，600和800 mg/kg茶多酚組奧尼羅非魚的肝體指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)；肥滿度和臟體指數(shù)各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 茶多酚對奧尼羅非魚生長和形體指標的影響Table 2 Effects of TP on growth and physical indexes of hybrid tilapia

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 茶多酚對奧尼羅非魚體成分的影響

茶多酚對奧尼羅非魚體成分的影響見表3。與對照組相比，飼料中添加600、800 mg/kg茶多酚顯著降低了全魚粗脂肪含量(P<0.05)。全魚水分、粗蛋白質和粗灰分含量各組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.3 茶多酚對奧尼羅非魚營養(yǎng)物質表觀消化率和腸道消化酶活性的影響

茶多酚對奧尼羅非魚營養(yǎng)物質表觀消化率和腸道消化酶活性的影響見表4。隨著飼料中茶多酚添加量的增加，干物質表觀消化率呈現(xiàn)先增加后降低的規(guī)律，在200 mg/kg茶多酚組顯著高于其他組(P<0.05)；粗蛋白質表觀消化率不受茶多酚添加量的顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，高添加量(600、800 mg/kg)的茶多酚顯著降低了腸道蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)。

2.4 茶多酚對奧尼羅非魚血清免疫指標的影響

茶多酚對奧尼羅非魚血清免疫指標的影響見表5。與對照組相比，飼料中添加200、400、600和800 mg/kg茶多酚均顯著增加了血清SOD和LZM活性(P<0.05)。二次曲線回歸分析表明，茶多酚添加量為438.89、412.35 mg/kg時，血清SOD和LZM活性分別最高(圖1)。血清MDA含量隨茶多酚添加量的增加表現(xiàn)出先降低后升高的規(guī)律，其中在200 mg/kg茶多酚組具有最小值。血清AKP活性各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 茶多酚對奧尼羅非魚體成分的影響(濕重基礎)Table 3 Effects of TP on body composition of hybrid tilapia (wet weight basis) %

表4 茶多酚對奧尼羅非魚營養(yǎng)物質表觀消化率和腸道消化酶活性的影響Table 4 Effects of TP on nutrient apparent digestibility and intestinal digestive enzyme activities of hybrid tilapia

表5 茶多酚對奧尼羅非魚血清免疫指標的影響Table 5 Effects of TP on serum immunological indexes of hybrid tilapia

圖1 血清SOD或LZM活性與茶多酚添加量的關系Fig.1 Relationships between TP supplemental level and serum SOD or LZM activities

2.5 茶多酚對嗜水氣單胞菌攻毒后奧尼羅非魚累積死亡率的影響

由圖2可見，攻毒后1 h，各組試驗魚均無死亡(存活率為100%)；攻毒后24 h，100、200、400和600 mg/kg茶多酚組的累積死亡率顯著低于對照組(P<0.05)；攻毒后48和96 h，200、400、600和800 mg/kg茶多酚組的累積死亡率均顯著低于對照組(P<0.05)，其中400 mg/kg茶多酚組累積死亡率最低。

相同時間點數(shù)據(jù)點標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。
Data points at the same time point with different small letters mean significant difference (P<0.05).
圖2茶多酚對嗜水氣單胞菌攻毒后奧尼羅非魚累積死亡率的影響
Fig.2 Effects of TP on cumulative mortality of hybrid tilapia challenged withAeromonashydrophila

3 討 論

3.1 茶多酚對奧尼羅非魚生長和消化功能的影響

茶多酚在水產(chǎn)動物上的研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加50～100 mg/kg茶多酚，顯著提高了團頭魴的增重率和特定生長率，上調了生長相關基因MaGHR2的表達[8]；飼料中添加50～100 mg/kg茶多酚后，在數(shù)值上提高了虹鱒的增重率，但差異未達顯著水平[6]。在羅非魚(Oreochromisniloticus)的試驗中，飼料中添加166 mg/kg茶多酚顯著提高了魚體的增重率，但添加333 mg/kg茶多酚未對生長性能產(chǎn)生有益影響[14]。同樣地，飼料中添加50 mg/kg茶多酚顯著提高了青魚(Mylopharyngodonpiceus)的特定生長率，而添加500 mg/kg茶多酚顯著降低了青魚的特定生長率[15]。本試驗在飼料中添加100～800 mg/kg茶多酚，結果發(fā)現(xiàn)對羅非魚生長性能無顯著影響，但100、200 mg/kg茶多酚有提高增重率的趨勢，而400、600和800 mg/kg茶多酚有降低增重率的趨勢，且800 mg/kg茶多酚組的增重率較200 mg/kg茶多酚組顯著降低。這表明，高添加量的茶多酚對魚類生長可能具有抑制作用。Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)，當飼料中綠茶渣添加量超過3.6%時，羅非魚的增重率降低，飼料系數(shù)增加。Welker等[17]也發(fā)現(xiàn)，虹鱒攝食含4%綠茶的飼料后，增重率顯著降低，飼料系數(shù)顯著升高，這可能也是高添加量的茶多酚所致。茶多酚是從茶葉中提取的酚類化合物，而酚類化合物通常被認為是飼料中的抗營養(yǎng)因子，能夠降低營養(yǎng)物質利用率和動物生長性能[18-19]。

本試驗中，添加100～400 mg/kg茶多酚顯著增加了奧尼羅非魚的干物質表觀消化率，但高添加量(600、800 mg/kg)的茶多酚則顯著降低了干物質表觀消化率，腸道淀粉酶和蛋白酶活性。在青魚飼料中添加50 mg/kg茶多酚，腸道蛋白酶和脂肪酶活性顯著增加，而添加500 mg/kg茶多酚后，腸道蛋白酶和脂肪酶活性顯著降低[15]。在小鼠飼糧中添加0.4%茶多酚后發(fā)現(xiàn)顯著降低了粗蛋白質表觀消化率[20]，用0.4%茶多酚灌喂小鼠后，腸道對水分、葡萄糖、膽固醇、氨基酸和礦物質的消化率顯著降低[21]。茶多酚能夠緩解腸道氧化應激，促進腸道有益菌的生長[22]，這有利于提高動物的消化吸收功能；但過量的茶多酚可能像其他多酚類物質一樣，能夠與蛋白質、糖類物質和礦物質結合，進而降低其消化率[23-25]。關于茶多酚影響魚類消化吸收功能的作用機制需要進一步的研究。

3.2 茶多酚對奧尼羅非魚體成分的影響

茶多酚可通過調節(jié)脂肪代謝相關激素如胰島素樣生長因子Ⅰ、瘦素和脂聯(lián)素等的含量和脂肪代謝相關信號通路基因的表達，降低攝食高脂飼糧小鼠的體脂肪含量[26-28]。分別灌喂80、160 mg/kg茶多酚后，肉雞皮下脂肪厚度、肌間脂肪寬度和腹脂率均顯著降低[29]。飼料中添加6.4%的綠茶渣顯著降低了羅非魚全魚粗脂肪含量，而全魚水分、粗蛋白質含量無顯著差異[16]。本試驗結果與之類似，飼料中添加茶多酚對奧尼羅非魚全魚水分和粗蛋白質含量無顯著影響，但是高添加量(600、800 mg/kg)的茶多酚顯著降低了全魚粗脂肪含量。這在虹鱒上也有類似報道，即低添加量(25～500 mg/kg)的茶多酚對全魚粗脂肪含量無顯著影響，但高添加量(1 000 mg/kg)的茶多酚顯著降低了全魚粗脂肪含量[6]。在低添加量(25、50 mg/kg)條件下，茶多酚提高了團頭魴幼魚肌肉粗蛋白質含量，但是對肌肉粗脂肪含量無顯著影響[8]?？梢姡瓒喾訉︳~類體脂沉積的影響與茶多酚的添加量有關，高添加量的茶多酚通常會抑制脂肪在魚體的沉積。

3.3 茶多酚對奧尼羅非魚免疫性能和抗病力的影響

4 結 論

① 飼料中添加200 mg/kg茶多酚具有促進奧尼羅非魚生長的趨勢。

② 飼料中添加400 mg/kg茶多酚可增加奧尼羅非魚的免疫性能，降低嗜水氣單胞菌攻毒后的累積死亡率。

③ 在本試驗條件下，奧尼羅非魚飼料中茶多酚的建議添加量為200～400 mg/kg。