盲腸灌注丙酸對(duì)生長(zhǎng)豬結(jié)腸黏膜基因表達(dá)的影響

陳慧子 張亞南 余凱凡 朱偉云

(江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京 210095)

近年來(lái)，腸道炎癥尤其是結(jié)腸疾病已成為威脅人類健康的重要因素，因此腸道健康尤其是結(jié)腸健康備受關(guān)注[1]。短鏈脂肪酸由未被宿主消化吸收的碳水化合物如非淀粉多糖(NSP)、寡糖、抗性淀粉等在腸道中經(jīng)過(guò)厭氧菌發(fā)酵形成，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，在結(jié)腸中濃度最高[2]。短鏈脂肪酸在體內(nèi)發(fā)揮多種生理功能[3-4]，它既可用于葡萄糖及脂質(zhì)的從頭合成[5]，又能抑制促炎因子的產(chǎn)生，從而起到抗炎作用[6]。因此，短鏈脂肪酸在機(jī)體代謝及腸道健康中發(fā)揮著重要作用。

前人研究大多圍繞著乙酸和丁酸對(duì)機(jī)體代謝的影響，而對(duì)丙酸的研究相對(duì)較少，但一些研究同樣證實(shí)了丙酸對(duì)機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)作用。丙酸是腸道內(nèi)糖異生的前體物質(zhì)，能夠激活宿主體內(nèi)與腸道糖異生有關(guān)的神經(jīng)通路[7]，改善機(jī)體的葡萄糖耐受性及胰島素敏感性[8]，降低脂肪的合成及血清膽固醇水平[9]。丙酸亦能通過(guò)其受體促進(jìn)胃腸激素酪酪肽(PYY)的生成，進(jìn)而調(diào)控宿主的食欲、胃腸蠕動(dòng)等，發(fā)揮一系列代謝益處[10]。此外，丙酸還能夠減少由脂多糖(LPS)引起的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌，降低白介素-6(IL-6)等免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平，改善機(jī)體的免疫水平[11]。本試驗(yàn)以生長(zhǎng)豬為模型，向盲腸灌注丙酸，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探究丙酸對(duì)結(jié)腸黏膜基因表達(dá)的影響，以期為研究丙酸在結(jié)腸代謝中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取16頭60日齡、25 kg左右的杜×長(zhǎng)×大閹公豬，單欄飼喂，自由飲水及采食。預(yù)飼3 d后，在盲腸實(shí)施T型瘺管手術(shù)。2周恢復(fù)期后，將試驗(yàn)豬隨機(jī)分成2組，分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組8頭。試驗(yàn)期內(nèi)，試驗(yàn)組豬只通過(guò)盲腸瘺管灌注用生理鹽水配制的丙酸溶液(25 mL，2 mol/L，pH 5.8)，對(duì)照組豬只灌注等量的生理鹽水，每天2次(07:00和18:00)，共灌注28 d。在第29天將16頭豬全部屠宰，采集結(jié)腸黏膜并迅速放置于液氮以供后續(xù)分析。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.2.1 總RNA提取

使用去RNA酶噴霧去除所需器械表面的RNA酶?？俁NA提取采用TRIzol法，參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。提取到的總RNA使用Nano Drop 2000測(cè)定其濃度及純度。

1.2.2 測(cè)序

將提取到的總RNA送至測(cè)序北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。用DNA酶去除DNA污染后，合成雙鏈cDNA。接著通過(guò)PCR擴(kuò)增富集片段并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)及測(cè)序。最后，去除低質(zhì)量及含有超過(guò)10%未知堿基的reads以獲得Clean reads[12]。

1.2.3 差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)的篩選

將結(jié)腸黏膜中所有表達(dá)的基因以P<0.05，F(xiàn)DR(false discovery rate)<0.01且差異倍數(shù)(FC)≥2作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因。

1.2.4 GO與KEGG pathway分析

使用Omicsbean系統(tǒng)對(duì)結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因進(jìn)行GO與KEGG pathway分析，以了解差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。GO是將基因進(jìn)行功能分類的體系，并使用標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格的詞匯及概念對(duì)各物種的基因?qū)傩赃M(jìn)行全方位的概括與描述。它包含3個(gè)一級(jí)功能數(shù)據(jù)庫(kù)：生物學(xué)過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cell component)和分子功能(molecular function)。KEGG pathway可對(duì)差異表達(dá)基因的代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行富集性分析，進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能。

1.2.5 蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction，PPI)分析

PPI分析仍通過(guò)Omicsbean系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。該系統(tǒng)先基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)建立起差異表達(dá)基因之間的相互聯(lián)系，再根據(jù)差異表達(dá)基因所主要參與的生物通路構(gòu)建模型，生成相應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 熒光定量PCR

從結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因中挑選7個(gè)與糖代謝及免疫等相關(guān)的基因[PYY、閉鎖蛋白-1(Occludin-1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(IGFBR7)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶1(GGT1)、G蛋白偶聯(lián)受體5A(GPRC5A)、核糖體蛋白S28(RPS28)]進(jìn)行熒光定量PCR，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。熒光定量PCR采用SYBR Green Mix reagents試劑盒法進(jìn)行，試驗(yàn)步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。選用豬甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參基因，各基因引物序列如表1所示。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因情況

灌注丙酸后，在生長(zhǎng)豬結(jié)腸黏膜中共檢測(cè)出121個(gè)差異表達(dá)基因(FC≥2，P<0.05)。其中表達(dá)上調(diào)的基因有78個(gè)，下調(diào)的基因有43個(gè)(圖1-A)。進(jìn)一步利用基因功能注釋發(fā)現(xiàn)，可功能注釋的差異表達(dá)基因包括49個(gè)上調(diào)基因和30個(gè)下調(diào)基因(圖1-B)。在這些差異表達(dá)基因中，包括一些糖代謝相關(guān)基因，如IGFBP7、果糖二磷酸醛縮酶(ALDOB)、GGT1等；能量代謝相關(guān)基因，如過(guò)氧化物酶生物合成因子(LOC100624129)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基4L(ND4L)、細(xì)胞色素P450(CYP39A1)等；免疫相關(guān)基因，如Occudin-1、生長(zhǎng)抑素(SST)、GPRC5A等；此外，還包括胃腸激素PYY等(表2)。

2.2 差異表達(dá)基因的GO分析

利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，解析差異表達(dá)基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程。上調(diào)表達(dá)基因的GO分析結(jié)果顯示，有12個(gè)顯著富集的GO term，包括糖基化合物代謝、糖類衍生物代謝、碳水化合物代謝以及前體代謝物和能量的生成等(圖2-A)。其中，富集在糖基化合物代謝途徑中的差異表達(dá)基因有4個(gè)，富集在糖類衍生物代謝途徑中的差異表達(dá)基因有7個(gè)，富集在碳水化合物代謝途徑中的差異表達(dá)基因有5個(gè)。下調(diào)表達(dá)基因的GO分析結(jié)果顯示，有8個(gè)顯著富集的GO term，包括心腔發(fā)育、干細(xì)胞群維持、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞因子刺激反應(yīng)的正調(diào)控等(圖2-B)。

表1 熒光定量PCR基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes selected for qPCR

圖1 差異表達(dá)基因數(shù)量(A)與可功能注釋的差異表達(dá)基因數(shù)量(B)Fig.1 The number of DEGs (A) and that of identifiable DEGs (B)

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG pathway分析

采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因參與的主要信號(hào)通路進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。差異表達(dá)基因顯著富集的通路主要包括氧化磷酸化、谷胱甘肽代謝、代謝通路、葉酸生物合成、糖胺聚糖生物合成等。對(duì)上調(diào)與下調(diào)表達(dá)基因分別進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)基因有5個(gè)通路顯著富集，包括氧化磷酸化、糖胺聚糖生物合成、鞘糖脂生物合成等(圖3-A)；下調(diào)表達(dá)基因顯著富集的通路有?；撬岷蛠喤；撬岽x、葉酸生物合成等(圖3-B)。

2.4 差異表達(dá)基因的PPI分析

采用Omicsbean系統(tǒng)構(gòu)建PPI模型，結(jié)果如圖4所示。在該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中，代謝通路占主導(dǎo)地位，與其有聯(lián)系的蛋白有ATP合成酶5I(ATP5I)、腸堿性磷酸酶(ALPI)、半胱氨酸雙加氧酶1(CDO1)、GGT1、線粒體ND4L(MT-ND4L)、線粒體ATP合成酶8(MT-ATP8)等。通過(guò)這些蛋白，該通路又與谷胱甘肽代謝、氧化磷酸化、甘鞘糖脂生物合成、糖胺聚糖生物合成等通路相互聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)腸道代謝。

2.5 熒光定量PCR

通過(guò)熒光定量PCR對(duì)結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，包括6個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因(PYY、Occludin-1、IGFBR7、GSTA1、GRPC5A、RPS28)和1個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因(GGT1)，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，熒光定量PCR與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中各基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相一致，從而證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。

3 討 論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探究了盲腸灌注丙酸對(duì)生長(zhǎng)豬結(jié)腸黏膜基因表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，丙酸灌注影響了一些參與糖代謝和能量代謝的基因如PYY、IGFBP7、ALDOB、LOC100624129、ND4L、CYP39A1等的表達(dá)，改變了腸道屏障功能及免疫相關(guān)基因如Occludin-1、SST、GPRC5A等的表達(dá)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO及KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)，丙酸使結(jié)腸黏膜在生物學(xué)過(guò)程和代謝通路上發(fā)生了顯著變化，主要涉及到糖代謝、能量代謝等。此外，差異表達(dá)基因在免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路也有富集。結(jié)果提示，丙酸改變了結(jié)腸黏膜中糖代謝及免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平，可能在結(jié)腸代謝及機(jī)體代謝中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

表2 部分差異表達(dá)基因功能列表Table 2 Function list of partial DEGs

Glycosyl compound metabolism：糖基化合物代謝；Localization within membrane：膜內(nèi)定植；Carbohydrate derivative metabolism：糖類衍生物代謝；Ensheathment of neurons：神經(jīng)元髓鞘形成；Adult feeding behavior：成人攝食行為；Neural precursor cell proliferation：神經(jīng)前體細(xì)胞增殖；Organophosphate metabolism：有機(jī)磷代謝；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代謝；Organonitrogen compound metabolism：有機(jī)氮化合物代謝；RNA localization：RNA定植；Cardiac chamber development：心腔發(fā)育；Stem cell population maintenance：干細(xì)胞群維持；Negative regulation of cell motility：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)負(fù)調(diào)控；Positive regulation of response to cytokine stimulus：細(xì)胞因子刺激反應(yīng)正調(diào)控；Innervations：支配；Antigen processing：抗原加工；Transport：運(yùn)輸；Cochlea development：耳蝸發(fā)育；Behavioral fear response：恐懼行為反應(yīng)；Negative regulation of biosynthetic：生物合成負(fù)調(diào)控。
圖2GO分析(A:上調(diào)基因；B:下調(diào)基因)
Fig.2 GO analysis (A: up-regulated genes; B: down-regulated genes)

差異表達(dá)基因富集的糖代謝及能量代謝相關(guān)GO term主要包括糖基化合物、糖類衍生物、碳水化合物代謝、糖胺聚糖生物、鞘糖脂生物合成、氧化磷酸化等。在糖基化合物生物學(xué)過(guò)程中，PYY、IGFBP7、ALDOB等基因的表達(dá)水平在丙酸的作用下顯著上調(diào)。PYY與許多消化過(guò)程有關(guān)，它能夠增強(qiáng)胰島素敏感性，抑制胃液分泌，降低腸胃蠕動(dòng)，參與維持機(jī)體能量平衡和葡萄糖穩(wěn)態(tài)[4,14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸能夠通過(guò)促使結(jié)腸分泌PYY進(jìn)而起到調(diào)控腸道蠕動(dòng)的作用[10]。IGFBP7是胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族成員，有研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP7能夠與IGF-1受體結(jié)合并通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子阻斷其激活[16]。ALDOB是糖異生過(guò)程中的重要酶類物質(zhì)，它能催化甘油醛-3-磷酸向果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)變。這些基因表達(dá)的改變表明，丙酸促進(jìn)了腸道葡萄糖生成，對(duì)腸道糖代謝及胃腸道消化吸收功能產(chǎn)生了影響。

Taurine and hypotaurine metabolism：?；撬岷蛠喤；撬岽x；Oxidative phosphorlation：氧化磷酸化；Ribosome：核糖體；Glycosaminoglycan biosynthesis：糖胺聚糖生物合成；Glycosphingolipid biosynthesis：鞘糖脂生物合成；Mucin type O-glycan biosynthesis：黏蛋白型O-聚糖生物合成；Prion diseases：朊病毒疾病；Metabolic pathways：代謝通路；Intestinal immune network for IgA production：免疫球蛋白A生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)；Cysteine and methionine metabolism：半胱氨酸和蛋氨酸代謝；Folate biosynthesis：葉酸生物合成；African trypanosomiasis：非洲錐蟲(chóng)??；Nicotine addiction：尼古丁成癮；Malaria：瘧疾；Glutathione metabolism：谷胱甘肽代謝；Arachidonic acid metabolism：花生四烯酸代謝；Taste transduction：味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)；Salivary secretion：唾液分泌；GABAergic synapse：GABA能突觸。
圖3KEGGpathway分析(A:上調(diào)基因；B:下調(diào)基因)
Fig.3 KEGG pathway (A: up-regulated genes; B: down-regulated genes)

Glutathione metabolism：谷胱甘肽代謝；Parkinson’s disease：帕金森??；Oxidative phosphorylation：氧化磷酸化；Glycosphingolipid biosynthesis：鞘糖脂生物合成；Lacto and neolacto series：乳糖和新乳糖；Glycosaminoglycan biosynthesis：糖胺聚糖生物合成；Keratan sulfate：硫酸角質(zhì)素；Systemic lupus erythematosus：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；Folate biosynthesis：葉酸生物合成；Taurine and hypotaurine metabolism：牛磺酸和亞?；撬岽x；Ribosome：核糖體。
圖4蛋白質(zhì)互作分析
Fig.4 PPI analysis

圖5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與熒光定量PCR中所選基因表達(dá)水平的差異倍數(shù)比較Fig.5 Comparison on FC of selected gene expression levels using RNA-seq and qPCR

此外，灌注丙酸后，結(jié)腸黏膜中氧化磷酸化過(guò)程也被顯著富集。其中，ATP合成酶ATP5I及LOC100624129、ND4L、CYP39A1等基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。氧化磷酸化是機(jī)體獲得能量的重要途徑。其中LOC100624129是一種過(guò)氧化物酶生物合成因子，ND4L是NADH脫氫酶亞基，CYP39A1是細(xì)胞色素P450，它們均是生物氧化過(guò)程的重要組成部分，能夠?qū)Ⅲw內(nèi)的糖、脂肪、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化產(chǎn)生能量以供機(jī)體生命活動(dòng)所需[17-18]。該結(jié)果提示，丙酸對(duì)結(jié)腸的能量代謝起到一定的調(diào)節(jié)作用。

除了在糖代謝及能量代謝中的影響外，本研究還發(fā)現(xiàn)，許多與免疫相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。前人研究顯示短鏈脂肪酸在結(jié)腸免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及腸道免疫系統(tǒng)發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[19-21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丙酸顯著上調(diào)了Occludin-1、SST、GPRC5A等與腸道屏障功能及免疫相關(guān)基因的表達(dá)。Occludin-1是一種重要的緊密連接蛋白，能夠維持細(xì)胞的通透性，保障腸道屏障功能[22-23]。SST能抑制炎癥因子的生成與釋放，從而抑制炎癥的發(fā)生與發(fā)展[24-25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SST會(huì)影響腸道上皮緊密連接，改善由內(nèi)毒素所導(dǎo)致的上皮緊密連接蛋白表達(dá)水平降低的狀況，有利于腸道屏障功能的維持[26]。GPRC5A是一種G蛋白偶聯(lián)受體，GPRC5A基因的敲除導(dǎo)致小鼠上皮細(xì)胞的核因子-κB(NF-κB)被活化，促進(jìn)了炎癥及腫瘤的發(fā)生[27-28]。GSTA1則能夠催化內(nèi)源性或外源性有害物質(zhì)與還原性谷胱甘肽結(jié)合，生成無(wú)毒衍生物被分解或排出體外，起到解毒作用，有利于維持機(jī)體的免疫水平[29]。因此，丙酸對(duì)這些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，揭示丙酸作為一種短鏈脂肪酸，對(duì)宿主腸道屏障及免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

生長(zhǎng)豬盲腸灌注丙酸，改變了結(jié)腸糖代謝和能量代謝，以及腸道屏障與免疫功能相關(guān)基因的表達(dá)，揭示丙酸對(duì)結(jié)腸代謝及機(jī)體健康有一定的調(diào)節(jié)作用。