基于外泌蛋白質組的釀酒酵母信號肽元件的分析及鑒定

田雷瑜，曹筠嵩，劉忞之，楊燕，王偉

藥用蛋白和工業(yè)生物催化劑通常天然含量很低，需要異源重組和表達制備，這需要發(fā)展一個穩(wěn)定的、易操作的和純化工藝可放大的高效生物表達系統(tǒng)。釀酒酵母細胞相對于大腸桿菌和哺乳動物具有高效的胞外分泌特點和易于遺傳操作的整合型或附加體型的表達載體，其已被廣泛用于重組蛋白的生物表達系統(tǒng)[1-2]。

酵母細胞自身外泌并轉運到細胞表面或發(fā)酵液中的蛋白可分為兩大類，一類蛋白是經過經典的內質網-高爾基體途徑（ER-Golgi）分泌的，這類外泌蛋白的前體通常含有信號肽，翻譯后首先被定向地轉運到內質網；另一類不含有信號肽的胞質蛋白如糖代謝酶、伴侶蛋白和翻譯起始因子等也可以經過非經典的 ER-Golgi 非依賴分泌途徑分泌到胞外，其外泌的分子機制還沒有闡明[3]。許多外泌蛋白和胞內膜蛋白在合成時都依賴于其 N-端的信號肽功能元件，細胞內膜定位的蛋白盡管也經過ER-Golgi 途徑轉運，但是其信號肽的下游和分子內部存在穿膜肽或 C-膜定位信號（如核定位信號肽）控制蛋白的亞細胞轉位[4]。分泌型的信號肽含有三個區(qū)域：N-、H- 和C- 區(qū)；N- 區(qū)含有堿性正電荷的極性氨基酸殘基，H- 區(qū)含有 7 ～ 15 個疏水氨基酸殘基（如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸）形成的 α-螺旋，跨越 ER 膜，促進新生肽的轉位，它是信號肽的主要功能區(qū)；分泌肽的 C-區(qū)含有極性結構，作為信號肽酶 I 的識別剪切位點，其中小的和中性氨基酸殘基（如丙氨酸和甘氨酸）位于剪切位點的 -3和 -1[5-6]。到目前為止，無論是在釀酒酵母還是在甲醇酵母的蛋白質工程研究中所使用最多的信號肽是釀酒酵母的交配型 α-因子的信號肽功能元件（85-aa prepro 區(qū)）[1]，其次是釀酒酵母的蔗糖水解酶的信號肽[7]。α-因子的信號肽功能元件不僅含有一個靶向內質網且由信號肽酶剪切的19 個氨基酸殘基信號肽，還含有一個 66 個氨基酸殘基的前導區(qū)[8-9]。因此由 α-因子引導的異源蛋白分泌表達在內質網腔內由信號肽酶剪切后，從內質網出芽并轉運進入高爾基體；然后在高爾基體腔內再由內肽酶 Kex2 剪切 2 個保守的堿性氨基酸殘基（Lys-Arg 或 Arg-Arg）的羧基端肽鍵釋放前導區(qū)，最后再包裝成囊泡轉運到細胞表面。因此，在蛋白的分泌過程中，如果沒有前導區(qū)的作用，可能會導致融合蛋白積聚在內質網；而其他信號肽（僅含有 pre 區(qū)）與 α-因子的前導區(qū)融合形成具有 α-因子野生型相似的功能元件，促進融合蛋白的外泌?？梢?α-因子的前導區(qū)在由內質網到高爾基體的轉位過程中起到非常重要的作用[8]。

目前，除 α-因子信號肽外，還有很多研究報道了釀酒酵母和甲醇酵母自身分泌蛋白的信號肽應用于異源蛋白的生物表達，如具有 α-因子信號肽相似結構的釀酒酵母 PIR 家族的細胞壁蛋白 CIS3和 HSP150 等多個信號肽用于人白細胞介素-2、脂肪酶、小鼠的唾液酸轉移酶等多個蛋白的外泌表達[10]。Massahi 和 ?al?k[11]系統(tǒng)地研究了甲醇酵母5 個信號肽對人生長激素表達的影響；此外，還有研究報道了異源的信號肽如菊粉酶的信號肽引導人皮質素蛋白在釀酒酵母中的分泌表達[12]。但綜合分析這些研究結果，很容易地發(fā)現釀酒酵母的α-因子信號肽依然是促進融合蛋白分泌表達的活性較好的功能元件[1]。為進一步從釀酒酵母中研究發(fā)現具有更好促分泌活性的信號肽功能元件，本研究基于釀酒外泌蛋白質組的研究結果，采用生物信息學手段進行計算分析，確定了 16 個定位于細胞壁的外泌蛋白信號肽元件，選取其中編碼外切β-(1,3)-葡聚糖酶 1（exo-1,3-beta-glucanase 1，EXG1）的信號肽元件為研究目標，以 α-因子信號肽的促分泌活性作對比分析，結果表明 EXG1 的信號肽功能元件具有較好的促分泌活性。

表 1 本研究使用的 PCR 擴增引物Table 1 PCR primers used in this study

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Escherichia coliTrans1-T1 購自北京全式金生物技術有限公司，用于質粒載體的構建；本實驗室保存的釀酒酵母 W303-1b/ΔES（E表示EXG1 基因敲除，S表示SPR1基因敲除）[13]為宿主進行酵母的轉化和融合蛋白的外泌表達。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 以釀酒酵母外泌蛋白質組（245 個外泌蛋白）為基礎數據[14]，利用 Uniprot（http://www.uniprot.org/uniprot/?query=&sort=score）數據庫下載每個蛋白的氨基酸殘基序列；Phobius軟件[15]（http://phobius.sbc.su.se）能夠很好地區(qū)分膜蛋白的穿膜螺旋和信號中疏水區(qū)，但其預測信號肽的敏感性和精確性稍差，因此先利用此軟件對每個外泌蛋白是否具有信號肽進行初步計算篩選；然后利用 SignalP4.1[16]（http://www.cbs.dtu.dk/services/Signa）lP/對經 Phobius 計算初選的含有信號肽蛋白進行更精確的計算分析，閾值設定為 0.5，計算得分值越高含有信號肽的可信度也越高；最后再分別利用 PSORT II[17]（https://psort.hgc.jp/form2.html）和 ProP1.0[18]（http://www.cbs.dtu. dk/services/ProP/）對上述篩選獲得的蛋白進行亞細胞定位和是否含有高爾基體蛋白酶 Kex2 的加工剪切位點進行預測分析，再利用 NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進行糖基化位點預測分析。

1.2.2 表達質粒構建

1.2.2.1 含有EXG1 基因表達載體的構建 以酵母基因組 DNA 為模板，以PDB ID 1H4P 的核酸序列為基礎設計合成引物（表 1），經 PCR 擴增獲得編碼EXG1的 DNA 片段，然后插入到表達載體 pδGAPh，該載體 pδGAPh 含有釀酒酵母三磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）基因啟動子、釀酒酵母δ 整合位點、釀酒酵母終止子磷酸甘油酸激酶 1（PGK1）和可利用潮霉素 B（HygB）進行篩選的HygB 激酶標記基因，經 CaCl2轉化法轉化大腸桿菌 Trans1-T1，篩選獲得陽性克隆，即得到酵母整合表達質粒 pδGAPh-EXG1。

1.2.2.2 含有 α-Factor 信號肽元件融合基因表達載體的構建 以 pPIC9K（invitrogen）質粒為模板，利用 A_F1/A_F2 引物對（表 1）經 PCR 擴增獲得 α-Factor 的信號肽功能元件，然后與 A_F3/A_F4引物對（表 1）所擴增的 EXG1 DNA 片段進行補平反應，最后再以 A_F1/A_F4 引物對擴融合DNA 片段，利用限制性內切酶NdeI 和EcoR I定向置換 EXG1 自身所對應的 DNA片段，即得到 pδGAPh-α-Factor-EXG1。

1.2.3 酵母轉化 參照文獻[19]報道的方法制備酵母感受態(tài)細胞和 DNA 轉化，把轉化體系涂布于含有相應抗生素的 YPD 平板上篩選，在 30 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3 d。將獲得的菌株轉接于含高濃度抗生素的篩選平板上進行高拷貝整合陽性克隆復篩。

1.2.4 陽性克隆的鑒定 目的基因轉化酵母細胞，篩選獲得陽性克隆，然后采用酵母基因組 DNA提取試劑盒提取基因組 DNA。通過 PCR 鑒定確定目的基因是否整合進入宿主的基因組中，最后再以各基因的特異引物對純化的 PCR 擴增片段進行測序驗證。

1.2.5 菌體生物量測定 測定OD600光密度值：取 1 ml 發(fā)酵液，稀釋一定倍數至OD600值在 0.2 ～0.8 之間，測定其OD600值，通過計算得到菌體生物量。

1.2.6 重組菌株外泌蛋白酶的活性測定 采用4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法測定 EXG1酶活[20]。配置不同濃度的對硝基苯酚，于 400 nm處測定吸光值并繪制標準曲線。酶活定義：每分鐘釋放 1 nmol 的對硝基苯酚所需要的細胞干重（mg）。挑取單克隆于 10 ml 液體 YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng) 15 ～ 20 h，以起始OD600= 0.2 轉接到 50 ml 液體 YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng) 24 h 后取適量發(fā)酵液置于滅菌的 1.5 ml EP管中，8000 r/min 離心 3 min，收集上清液。取上清液 50 μl，加入 50 μl 的 20 mmol/LpNPG（溶于 pH 6.0 的醋酸鈉緩沖液中），混勻，30 ℃ 反應15 min，立即加入 100 μl 的 10%（W/V）Na2CO3終止反應，反應過程中釋放出對硝基苯酚，利用PerkinElmer 酶標儀于 400 nm 測定吸光值。

2 結果

2.1 釀酒酵母外泌蛋白質組的生物信息學分析

2.1.1 外泌蛋白信號肽的計算確定 釀酒酵母與哺乳動物細胞一樣具有依賴內質網-高爾基體分泌的經典和非經典的分泌途徑[3]，外泌蛋白如果經過經典途徑分泌，則發(fā)生在內質網腔內信號肽酶或高爾基體腔內切蛋白酶 Kex2 的剪切，導致外泌蛋白質組的質譜分析檢測不到信號肽的整個功能元件區(qū)。因此，本研究利用 Uniprot 對文獻報道的245 個外泌蛋白所對應全長氨基酸殘基序列進行下載整理，這些蛋白質氨基酸序列首先利用計算程序 Phobius 預測分泌信號肽和信號肽酶的剪切位點，然后再利用計算程序 SignalP4.1和 PSORT II進行驗證，經計算分析總計獲得 65 個含有信號肽結構的外泌蛋白，其中含有 prepro 區(qū)的蛋白16 個（表 2），僅含有信號肽 pre 區(qū)的外泌蛋白49 個，計算程序 Phobius 和 PSORT II 預測的不同剪切位點在表 2 中已標注。

表 2 釀酒酵母含有 prepro 區(qū)的信號肽Table 2 List of endogenous and exogenous signal peptides with prepro-region for Saccharomyces cerevisiae

續(xù)表 2

續(xù)表 2

圖 1 外泌蛋白信號肽酶剪切位點的統(tǒng)計分析（P1 表示信號肽酶剪切位點-1）Figure 1 Statistical sequence analysis of predicted signal peptidase cleavage sites (P1 of the logos corresponds to the position -1 of signal peptidase cleavage site in the substrate)

2.1.2 信號肽酶剪切位點的結構 針對 65 個信號肽功能元件的計算分析結果可以看出，分泌型的信號肽含有明確的 N-、H- 和 C- 區(qū)，圖 1 是對信號肽酶剪切位點 -6 到 -1 和 +1 到 +6 位氨基酸殘基的分析結果。-3 和 -1 是信號肽酶特異識別的位點，-1 位置氨基酸殘基的頻次分別為 Ala（51）、Gly（6）、Ser（5）；-3 位置氨基酸殘基分別為高度保守的小的氨基酸殘基 Val（26）、Ala（22）、Ile（7）、Ser（4）；從圖 1 也可以明顯看出+1 位置多為小的疏水性的氨基酸殘基 Ala、Leu、Ser；另一個重要而顯著的結果為 Pro 在 +2 和 +4位置出現頻次最高，再結合 -1 或 -6 位置出現Gly，可以得出在信號肽酶識別位點區(qū)形成一個β-轉角或 Loop 區(qū)是一個必需的活性結構。

2.1.3 信號肽功能元件中前導區(qū)的糖基化位點 已有研究證實釀酒酵母 α-因子信號肽的前導區(qū)有 3 個糖基化位點，其位點突變導致融合外泌蛋白的分泌降低[21]。本研究利用 NetNGlyc1.0 計算程序對每個外泌蛋白進行糖基化位點預測分析，預測的糖基化位點與文獻實際測定分析到的位點存在很大的差異[14]，可能原因是外泌蛋白豐度本來就較低，而相應的肽段很難檢測。在預測的含有前導區(qū)的 16 個信號肽功能元件僅有磷脂酶 B（PLB3）含有一個糖基化位點，已得到實驗證實的信號肽功能元件如 CIS3、HSP150 與 α-因子信號肽的結構相似，能夠引導融合異源蛋白的外泌表達，說明信號肽前導區(qū)的糖基化不是必需條件。圖 2是含有前導區(qū)的信號肽功能元件的對比分析，可以看出有些信號肽功能元件如 EXG1、SCW4、SCW10和 SUN4 等含有較短的前導區(qū)，但已有研究結果證實 EXG1 被定位于高爾基體腔中的內切酶 Kex2剪切[22]。

2.1.4 信號肽功能元件中 Kex2 剪切位點的分析 外泌蛋白的信號肽如含有前導區(qū)，其分泌表達需要在高爾基體腔內被 Kex2 剪切加工，本研究利用計算程序 ProP1.0 進行預測分析，該軟件的精確性較差，使用已得到廣泛證實的 α-因子信號肽作對照進行分析，其預測分數為 0.374（閾值為 0.5），通過氨基酸序列的比對分析 16 個外泌蛋白含有前導區(qū)的信號肽，僅有 6 個信號肽的預測值大于0.5（表 2），從圖 2 可以看出前導區(qū) Kex2 剪切位點非常保守（2 個堿性的氨基酸殘基 Lys-Arg）。

圖 2 預測含有前導區(qū)的信號肽的比對分析Figure 2 Alignment of predicted signal peptidase and endopeptidase Kex2 cleavage sites

圖 3 工程酵母基因組整合的目的基因的 PCR 鑒定（A：EXG1 DNA 片段；B：α-Factor-EXG1 DNA 片段）Figure 3 PCR verification results of genetically engineered strains with integration of two heterologous genes (A: EXG1 DNA fragments amplified by PCR; B: α-Factor-EXG1 DNA fragments amplified by PCR)

2.2 EXG1 信號肽功能元件的促分泌活性分析

2.2.1 含 EXG1 信號肽功能元件融合表達載體的構建和酵母轉化 通過生物信息學分析獲得的16 個含有前導區(qū)的信號肽，其中 CIS3、HSP150、PIR3、PIR1 為同一個家族的外泌蛋白，結構與α-因子信號肽相似，已有研究結果證實 HSP150 的信號肽功能元件具有與 α-因子信號肽相同的促進小鼠唾液酸轉移酶分泌的表達水平[10]；基于其他信號肽的前導區(qū)都較短的分析結果，于是推測其他的前導區(qū)是否具有較 α-因子信號肽更強的促分泌活性。本研究選取 EXG1 研究目標進行探索。首先利用 PCR 方法直接從酵母基因組中擴增獲得EXG1 整個基因，亞克隆到釀酒酵母整合型表達載體 pδGAPh，即得到 pδGAPh-EXG1；同時利用α-因子信號肽功能元件作為參照，利用 SOE-PCR獲得編碼 α-因子信號肽 DNA 片段，直接置換EXG1 自身的信號肽編碼區(qū)，獲得整合型表達載體pδGAPh-α-Factor-EXG1。然后轉化已基因敲除EXG1 的宿主菌 W303-1b/ΔES，通過潮霉素 B 抗性篩選標記進行陽性克隆的篩選，然后通過 PCR鑒定確定 EXG1 和 α-Factor-EXG1 是否整合進入宿主的基因組中，結果如圖 3 所示陽性克隆都有預期的整合基因片段，進而純化 DNA 片段并測序驗證。

2.2.2 EXG1 信號肽功能元件的促分泌活性 EXG1 編碼的外切 β-(1,3)-葡聚糖酶 1 具有水解pNPG 的 β-葡萄糖苷鍵的活性，利用對硝基苯酚繪制標準曲線（圖 4），標準曲線線性良好；測定發(fā)酵上清中糖苷水解酶活性，結果表明使用EXG1 自身的信號肽比 α-因子信號肽引導的 β-葡萄糖苷酶水解活性更高，約是后者的 3 倍，同時也觀察到 EXG1 的高表達對細胞沒有生長抑制作用。因此，EXG1 的信號肽功能元件具有較好的促進融合蛋白分泌的活性（圖 5）。

圖 4 對硝基苯酚的濃度標準曲線Figure 4 Standard curve of p-nitrophenyl measured by PerkinElmer

圖 5 工程菌的生物量（A）和胞外 β-葡萄糖苷酶活性的測定（B）Figure 5 The determinations of biomass (A) and the supernatant enzymatic activities of the recombinant strains (B)

3 討論

釀酒酵母之所以能成為眾多藥用蛋白和工業(yè)催化酶的生產表達系統(tǒng)，不僅僅是其具有遺傳操作便捷、培養(yǎng)簡單和繁殖迅速等優(yōu)點，更重要的是其自身具有較強的 ER-Golgi 依賴的分泌途徑[3]。外泌蛋白進行分泌表達的第一個關鍵步驟是外源蛋白的信號肽對分泌途徑的選擇性，依據信號肽識別體轉運新合成的外泌蛋白到內質網的分子機制把外泌蛋白靶向內質網的轉運過程區(qū)分為翻譯共轉移途徑和翻譯后轉移途徑。目前在酵母表達系統(tǒng)中應用最廣泛的信號肽是 α-因子信號肽功能元件，利用翻譯后轉移途徑驅動融合蛋白的外泌表達，為提高外源蛋白的表達量提供了一個靶點。

目前文獻已報道了多種用于提高異源蛋白在酵母細胞高效表達的技術策略，主要包括對分泌途徑中相關基因的敲除或高表達、優(yōu)化表達載體系統(tǒng)和發(fā)酵過程及其調節(jié)伴侶蛋白促進內質網膜上的蛋白折疊和二硫鍵的形成[1]。但是如何提高異源蛋白在胞內從內質網到高爾基體的內膜系統(tǒng)囊腔內的轉位依然是影響融合蛋白外泌效率的決定因素，其中信號肽功能元件是在該膜系統(tǒng)內轉位的關鍵分子結構。過去很多研究集中在不同信號肽（實質上是信號肽的前導區(qū)）的發(fā)現鑒定研究，而對信號肽包括前導區(qū)的下游元件對外泌蛋白的影響研究相對較少[8]。本研究直接基于釀酒酵母細胞外泌蛋白質組的研究結果，采用生物信息學計算方法，快速發(fā)現具有促進蛋白外泌表達的信號肽功能元件。經計算分析獲得了 65 個具有潛在分泌表達的信號肽，而這些蛋白絕大多數定位于細胞壁或胞外發(fā)酵液；進一步分析確定了含有前導區(qū)的 16 個信號肽功能元件，這與 Bae 等[10]利用翻譯融合伴侶篩選系統(tǒng)分離鑒定具有較強促進人白細胞介素-2 表達的多個信號肽功能元件（如 ECM33、HSP150、CSI3 和 SCW4）得以相互印證，而后者還融合表達了信號肽功能元件下游更長的結構蛋白肽段。通過計算分析和結構預測可以看出在信號肽酶剪切位點下游的 +1 到 +6 的肽段含有導致 α-螺旋斷開的 Gly 或 Pro 的氨基酸殘基，推測可能形成易于信號肽酶識別剪切的 β-轉角或環(huán)狀結構，該結構是影響信號肽酶剪切的重要分子結構。

為驗證通過計算方法獲得的信號肽功能元件的可靠性和促進融合蛋白分泌的效率，選取其中與α-因子信號肽結構不同的 EXG1 的信號肽功能元件為研究目標，利用基因敲除 EXG1 的酵母為表達宿主消除內在 EXG1 的潛在影響因素。研究結果表明 EXG1 信號肽功能元件比常用的 α-因子信號肽功能元件具有更強的促蛋白分泌活性。總之，隨著蛋白質組和轉錄組等系統(tǒng)生物學技術的發(fā)展，利用這些組學的研究結果并結合計算分析，可以快速地分離鑒定促進蛋白外泌表達的功能元件，這些元件的發(fā)現也將促進蛋白質工程研究和藥用蛋白的生物合成。