表觀遺傳學對腫瘤干細胞及其耐藥性的影響

鄒庚藝，張曉彤，李惠霞

作者單位：300071 天津，南開大學醫(yī)學院（鄒庚藝、張曉彤）；300060天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/天津市腫瘤防治重點實驗室/天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心（李惠霞）

現(xiàn)如今，腫瘤仍是危害人類健康的重大疾病，對于腫瘤的起源主要有兩種觀點，即克隆形成學說和腫瘤干細胞模型。后者認為腫瘤是由一群包含各種表型和生物學特征的細胞組成，這些細胞具有很強的異質(zhì)性[1]，腫瘤形成的關鍵在于其中一小部分類似于成體干細胞的腫瘤細胞，它們分化程度低，致瘤能力強，具有自我增殖及多向分化的潛能，被稱為腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）[2-4]。腫瘤干細胞與腫瘤的復發(fā)、進展有著密不可分的聯(lián)系。其中重要的特性莫過于細胞可長期處于靜息狀態(tài)，腫瘤干細胞的細胞間期延長，化療藥物不能對其產(chǎn)生殺傷作用，當其進入分裂期的時候，會導致腫瘤復發(fā)。本文主要關注表觀遺傳學對腫瘤干細胞的分裂、自我更新以及擴散的影響。

1 腫瘤干細胞的來源與特征

有假說認為，腫瘤干細胞的起源是由于成體干細胞的突變以及錯誤的信號調(diào)節(jié)造成的。位于器官組織中的成體干細胞可以維持靜息期，這對腫瘤干細胞的產(chǎn)生有著一定的助力[5]。近年來，不斷有研究表明，腫瘤干細胞是由于成體干細胞基因錯配而形成，同時腫瘤干細胞又保留了成體干細胞無限增殖的特性[6]。祖細胞是一種來源于干細胞的早期分化類型，相較于干細胞它有更為定向的細胞特征，比如較低的自我更新能力以及有限的復制性[7]。關于祖細胞的特性，很多研究顯示其可以分化成為腫瘤干細胞。一個正常的祖細胞，經(jīng)過誘導后可以分化成多種家系的腫瘤干細胞[8]。另一個關于腫瘤干細胞起源的說法是，體細胞可以作為腫瘤的起源細胞，這種說法首先在 Mintz 等[9]的實驗中被證明，他們通過向 6 d 胎齡的小鼠胚胎中注射早期發(fā)育畸形的胚胎細胞，證明腫瘤早期可以來源于體細胞的突變。最近關于體細胞細胞核的基因重排可以發(fā)育成為誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的發(fā)現(xiàn)也同樣可以證明這一假說[10]。

盡管關于腫瘤干細胞來源的方式說法不一，但是這兩種理論的走向是基本一致的。無論是腫瘤始動細胞或是腫瘤干細胞，不考慮它們的來源方式，只觀察其細胞功能可以發(fā)現(xiàn)，它們都具有自我更新的能力，可以進行自我復制，同時不會失去腫瘤的異質(zhì)性。眾多的腫瘤干細胞使得腫瘤組織不斷地增生繁殖，從一個小的亞群，逐漸發(fā)展并占據(jù)大部分組織。

眾所周知，正常的成體干細胞的主要功能就是為其所在的組織提供分化的最終產(chǎn)物——能夠維持組織穩(wěn)定性及功能的體細胞。和正常的成體干細胞一樣，腫瘤干細胞的存在也是為了能夠保持腫瘤組織無限的增殖和自我更新，同時分化成為具有特定功能的細胞表型。對于這類腫瘤干細胞，科研人員們有著這樣的定義：腫瘤干細胞是一類能夠致癌的細胞群，它們對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用，同時可以維持、調(diào)控腫瘤的固有特性，例如細胞的靜息期、無限制的自我更新、對化療和放療的內(nèi)在抗性等，以及定向分化成為子代腫瘤細胞的能力[11]。當在體外培養(yǎng)腫瘤干細胞時，其呈現(xiàn)出一種錨定-不依賴性的生長狀態(tài)，對外源生長刺激因子的依賴較少、失去細胞接觸抑制效應，導致永生化，這種錨定-不依賴性生長是腫瘤細胞的特征之一。靜息狀態(tài)下的腫瘤干細胞的永生性是其最有競爭優(yōu)勢的增長特征，在擴增過程中其可以無限增殖，并可以通過不平衡的增長潛能發(fā)育成兩種表型的細胞，一種是可以定向分化成腫瘤的成體細胞，其并沒有無限增殖的潛能；另一種是與腫瘤干細胞具有相同功能的子代細胞，它具有無限增殖的潛能，這種增殖方式被稱之為自我更新，大部分腫瘤組織是由分化水平高的子代腫瘤細胞構(gòu)成的。同時腫瘤干細胞還具有另一個特征就是在體外培養(yǎng)的克隆形成以及體內(nèi)培養(yǎng)的成瘤特性。

總之，這些結(jié)果都表明腫瘤干細胞與正常干細胞具有較高的相似性。如前所述，干細胞的特性在很大程度上受表觀遺傳學的調(diào)控，由此思考表觀遺傳學在調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的功能和表型中也具有重要作用。

2 表觀遺傳學對腫瘤干細胞的調(diào)控

在體細胞重新編碼的進程中，逆轉(zhuǎn)錄病毒、非病毒載體或者是化學手段產(chǎn)生的過表達轉(zhuǎn)錄因子使得相應的核染色質(zhì)重塑，以完成體細胞向干細胞的轉(zhuǎn)換。重新編碼是以循序漸進的方式進行的，首先是要重新編碼的細胞因子和 DNA上與干細胞相關的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制分化的基因，使其不再表達相應的蛋白。同時染色質(zhì)重構(gòu)會通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)中的蛋白表達，去除大部分或者所有與細胞分化相關的分子標志物，將體細胞從已經(jīng)分化的狀態(tài)轉(zhuǎn)化成未分化的干細胞[12]。同樣的過程也會發(fā)生在腫瘤干細胞的形成中，無論是從成體干細胞、祖細胞或者是已經(jīng)分化的體細胞來逐漸演變成為腫瘤干細胞，上述過程都是不可缺少的。這些與腫瘤起始相關的細胞會經(jīng)歷一個相似的 DNA 甲基化以及染色體重排的過程，最終形成有致癌能力的腫瘤干細胞。

因此，在腫瘤形成的過程中，表觀遺傳學對其的調(diào)控主要存在兩種機制：①通過暴露原癌基因位點促進轉(zhuǎn)錄因子過表達，以調(diào)控中間產(chǎn)物為主，促進腫瘤的形成；②促進腫瘤發(fā)生的始動因子的過表達，成為腫瘤形成過程中的起始因素。我們現(xiàn)階段對于表觀遺傳學是通過哪些機制，哪些通路來調(diào)控克隆細胞的增殖以及相關基因表達的知識廣度以及深度是遠遠不夠的，特別是對其中的關鍵事件的了解更是有限。每個腫瘤基因啟動子甲基化的中位頻率為 250 ～ 800，根據(jù)腫瘤的不同類型，非同義替換基因發(fā)生突變的頻率不同，其最高在 150 ～ 170[13]。此外，正常細胞和腫瘤細胞中自發(fā)的突變率約為每個分區(qū)的每核苷酸堿基對的 10-10[14]，與這個突變率相比，發(fā)生錯配甲基的頻率會高很多，每個分區(qū)的每個 CpG 雙核苷酸大約為 2 × 105[15]。因此盡管原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的 DNA 超甲基化相關的重要啟動子是一致的，然而復制 DNA 甲基化的高錯配率或許表明，在腫瘤進展的過程中表觀遺傳上對 DNA 的修飾比基因本身的遺傳變異性更加多變難測。

因此，表觀遺傳變異性對腫瘤進展的確切作用仍需要更為深入的研究。表觀遺傳學對染色體的眾多修飾過程中，甲基化能夠傳遞到子代，同時當它精準地定位到編碼區(qū)時能夠直接影響基因所行使的功能，對器官以及組織的功能產(chǎn)生影響。因此，或許可以利用其進行克隆篩選，同時影響腫瘤異質(zhì)性的形成。無論是偶然發(fā)生的表觀遺傳學改變或是異常轉(zhuǎn)錄都可以作為潛在的篩選條件對細胞的基因畸變進行遴選，包括抑癌基因的沉默或是 DNA 修復基因的缺失。這種表觀遺傳學的改變可以增加細胞的可塑性，在腫瘤進展的過程中，可以促進腫瘤起始亞群的形成。關于腫瘤干細胞的起源，還有一種等級假說，認為腫瘤干細胞是一群穩(wěn)定的突變細胞亞群，有著誘發(fā)腫瘤發(fā)生的能力，有著不同的腫瘤細胞表型，一個腫瘤中存在不同表型的干細胞，有特定的表型能夠適應當前腫瘤所提供的微環(huán)境而進行增殖，而有的細胞表型則更加適應其他的微環(huán)境。無論是根據(jù)這些理論中的哪一個或是將這些理論組合在一起來理解，腫瘤細胞群其內(nèi)在固有的異質(zhì)性都與表觀遺傳學的修飾密不可分。

等級假說理論與細胞的可塑性模型之間一直存在分爭。然而現(xiàn)在已有證據(jù)證明，表觀遺傳學的修飾可以使細胞在干細胞狀態(tài)和定向分化后具有功能的細胞間轉(zhuǎn)化。在腫瘤中發(fā)生的上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）現(xiàn)象也同樣會發(fā)生在正常細胞的轉(zhuǎn)化過程中[16]。EMT 的過程中，間充質(zhì)細胞和干細胞有很多的相似之處，例如持續(xù)的自我更新以及遷移能力。上述這些行為，在健康成人的細胞更新中同樣也會發(fā)生，組織中細胞的更新需要這些反應來作為基石。這種內(nèi)在的細胞行為在正常細胞和癌癥相關的上皮新生細胞中都可觀察到，不同的信號傳導會使細胞在上皮細胞和間充質(zhì)細胞之間進行轉(zhuǎn)化，在特定的細胞微環(huán)境下可以改變細胞的表型[16]。相較于正常細胞，在癌變細胞中，這種轉(zhuǎn)化過程會進行得更加高效。就以乳腺癌細胞為例，數(shù)據(jù)顯示，類似于干細胞表型的細胞或是間充質(zhì)細胞可以在腫瘤進展的任何時間點出現(xiàn)、轉(zhuǎn)化等，使有著上皮細胞特性的腫瘤組織中的細胞表型更加豐富[17]。表觀遺傳學是如何調(diào)控上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化這一過程的呢？有一種假設，在任何特定的時間點上發(fā)生的上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，其決定因素主要是關鍵轉(zhuǎn)錄因子的染色質(zhì)調(diào)節(jié)及其下游分子標志物的表達[18]。

在這種假設的調(diào)節(jié)機制中，Wnt 和 TGF-β 的激活，以及 E-cadherin 的表達調(diào)節(jié)都是該通路的關鍵分子。在未分化狀態(tài)中，存在一些基因的控制區(qū)域（或啟動子），尤其是那些對于發(fā)育至關重要的基因，這些區(qū)域通過與被激活或抑制的組蛋白進行“交流”，保持可塑性，生物學家將這種狀態(tài)命名為“二價狀態(tài)”。為了調(diào)節(jié)染色質(zhì)的表達，基因沉默在此起到了很大的作用?；虺聊?PcG 蛋白以及其伴隨的 H3K27me3 標記調(diào)控，來控制啟動子的“二價狀態(tài)”[19]。因此，當間充質(zhì)細胞或是其他干細胞樣的細胞表型在維持這種“二價狀態(tài)”時，細胞中表達 E-cadherin 的基因會處在一個靜息狀態(tài)，當與 Wnt 和 TGF-β 激活相關的基因的表達被抑制時，維持上皮細胞表型的相關信號通路的表達就會增加，細胞可塑性的關鍵在于，在大多數(shù)的上皮細胞中基因通常被維持在“二價狀態(tài)”。相反而言，當與Wnt 和 TGF-β 激活相關的基因的表達被激活時，會觸發(fā)上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進程。關于染色質(zhì)調(diào)控的分子機制（“二價狀態(tài)”的染色質(zhì)與異常啟動子導致的 DNA 甲基化）是現(xiàn)階段在癌癥中關于細胞可塑性的關鍵因素。同時，細胞的狀態(tài)能影響腫瘤早期的進展，這一現(xiàn)象或許在癌前病變中就已經(jīng)出現(xiàn)，作為起始步驟導致腫瘤的進展。這些表觀遺傳學的改變，令具有癌變趨勢的細胞能夠與慢性感染中的細胞一樣，在細胞增殖過程中保留其表型[20]。在細胞代謝過程中，PcG 蛋白和 DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的復合物能夠迅速地整合進啟動子、CpG 島以及與轉(zhuǎn)錄沉默相關的基因中[21]。

在 DNA 損傷修復過程中，如果發(fā)生錯誤，當轉(zhuǎn)錄沒有停止時，這個錯誤將會在每一代細胞中進行累積。所以上述的轉(zhuǎn)換過程通?？梢宰鳛檫^渡事件來保護啟動子區(qū)的正常代謝。然而，在慢性炎癥和“二價狀態(tài)”或是典型的 PcG標記基因所導致的低轉(zhuǎn)錄狀態(tài)等外周環(huán)境影響下，或許會使啟動子對于上述蛋白的復合物以及異常累積的 DNA 甲基化的抗性更差[22]。干細胞相關基因的染色質(zhì)異常甲基化以及染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄抑制能夠減少細胞群的可塑性，使細胞維持異?？寺。趽p失分化能力的同時保留自我更新的能力[22]。這種類型的染色質(zhì)改變，也可以影響到腫瘤細胞亞群的生成，以及該亞群腫瘤細胞異質(zhì)性的維持，這與腫瘤的進展和復發(fā)以及自我更新是密不可分的。這些細胞亞群有著較少的可塑性，不易逆轉(zhuǎn)其細胞的干性特點，這一細胞特征就給了腫瘤在任何時間點上都有進展和復發(fā)的機會（圖 1）。

圖 1 表觀遺傳學對腫瘤干細胞的影響

3 表觀遺傳學對癌癥治療及治療抵抗的影響

通過改變腫瘤細胞的表觀遺傳抑制腫瘤進展是一種較為新穎的治療方法。晚期腫瘤難以治愈的重要原因之一在于腫瘤細胞的耐藥性，改變耐藥腫瘤細胞的表觀遺傳能夠改變治療過程中的耐藥性問題。如今，表觀遺傳學無論在開發(fā)新抑癌藥物方面還是在改變腫瘤細胞的耐藥性方面都已經(jīng)得到了越來越多的關注。表觀遺傳相關的治療在保護、延緩甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性方面存在巨大的潛力。最近有綜述報道，應用小分子物質(zhì)能夠逆轉(zhuǎn) DNA 甲基化和組蛋白的去乙?；崾疚覀冞x取其他靶向藥物來調(diào)節(jié)染色質(zhì)調(diào)控蛋白[23]。其中背景之一是近期一個令人興奮的數(shù)據(jù)，提示染色質(zhì)改變可同步出現(xiàn)在相關的干細胞群體中，同時提示了染色質(zhì)改變在多重治療的治療性耐藥的演變中的作用[24]。當然，對靶向治療，這些抵抗是由靶分子在直接下游通路發(fā)生或者互補通路中直接產(chǎn)生的新突變造成[25]。因此，表觀遺傳的改變能在腫瘤細胞的耐藥性中起重要作用。事實上，腫瘤細胞耐藥性的可逆模型已經(jīng)在實驗室中成功獲得。這種腫瘤細胞耐藥性，在行停藥處理或者組蛋白去乙酰酶抑制劑處理后可被逆轉(zhuǎn)，這與有異質(zhì)性的腫瘤細胞群或經(jīng)誘導的腫瘤干細胞所產(chǎn)生的耐藥性相一致。相反，在這些存在耐藥性的細胞亞群中有一個共同的特點就是 H3K4me3 脫甲基酶和人賴氨酸特異性脫甲基酶 5A（JARID1A）處于非常高的水平，而 H3K4me3 在所有細胞中表達較低。JARID1A 作為相關蛋白在維護腫瘤啟動細胞的功能上起著重要作用[26]。這些數(shù)據(jù)證明腫瘤細胞亞群的干細胞樣表型和染色質(zhì)改變是有可塑性的，這些可逆的表觀遺傳異?？赡軐τ性l(fā)耐藥的腫瘤亞群提供潛在的治療策略。表觀遺傳相關的治療作為一種預備治療手段，可能對那些藥物或者常規(guī)靶向化學治療抵抗的腫瘤細胞敏感。

4 結(jié)論與展望

研究表明，表觀遺傳學機制在腫瘤干細胞的多向分化和調(diào)控中發(fā)揮非常重要的作用，但目前的成果并不能使我們對腫瘤干細胞的表觀遺傳組學特點有一個全面的了解。隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展，獲得了上千種腫瘤的全基因組DNA 序列，同時也推動了表觀遺傳學的全基因組測序，目前許多腫瘤的表觀遺傳學圖譜已經(jīng)明確，下一步，最需要的就是排除腫瘤中的異質(zhì)細胞，對關鍵的腫瘤干細胞的表觀遺傳學修飾進行全基因組范圍的檢測，明確腫瘤干細胞表觀遺傳基因組，以真正推動腫瘤的臨床診斷、治療以及預防。