線粒體非折疊蛋白反應對運動性骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用

樊曉Chun-Guang LI王平

1浙江理工大學體育教研部（杭州 310018）2 National Institute of Complementary Medicine，Western Sydney University 3杭州師范大學體育與健康學院（杭州 311121）

骨骼肌是機體最主要的運動應答器官，也是物質(zhì)能量代謝的重要場所。運動可使骨骼肌在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等方面產(chǎn)生生理性適應和良性重塑，諸如線粒體生物發(fā)生、線粒體自噬等線粒體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的重塑[1]。骨骼肌收縮時，其能量需求急劇遞增，能量的高效產(chǎn)出和穩(wěn)定供給是維持骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)的重要保證[2]。骨骼肌線粒體既是細胞的物質(zhì)代謝中心，也是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的集控中心，對于維持骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)起著重要作用[3]。線粒體大約含有1000多種蛋白質(zhì)，絕大多數(shù)線粒體蛋白由核基因編碼，在核糖體形成并轉(zhuǎn)運到線粒體，也有13種參與三羧酸循環(huán)的酶類是由線粒DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）編碼的[4]。因此，線粒體蛋白質(zhì)的正確折疊、裝配和非折疊蛋白的有效清除和轉(zhuǎn)換，是保證線粒體功能穩(wěn)定的先決條件[5]。研究表明，先天性線粒體缺陷可導致嚴重的多系統(tǒng)疾病，線粒體功能異?？梢鸫x性疾病、衰老和神經(jīng)退行性疾病[6]。

正常情況下，線粒體非折疊蛋白的量與折疊蛋白的分子伴侶精確配對，如果分子伴侶不足，線粒體基質(zhì)會積累大量非折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，這可造成細胞器包括線粒體損傷。最近研究顯示，骨骼肌對觸發(fā)UPRmt的生理、病理性刺激非常敏感，組織缺氧、氧化應激、禁食、合成代謝、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等因素均可誘導UPRmt[7]。病理因素諸如線粒體DNA耗盡、線粒體錯誤折疊蛋白的積累、線粒體核糖體損傷、線粒體分子伴侶和蛋白酶減少、氧化磷酸化紊亂、葡萄糖高消耗、線粒體源性高活性氧（reactive oxygen species，ROS）、環(huán)境溫度、毒素等因素也會影響UPRmt[8]。在應激狀態(tài)下，核基因編碼的線粒體分子伴侶熱激蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）、熱激蛋白 70（heat shock protein 70，HSP70）等均表達上調(diào)，幫助已錯誤折疊的蛋白恢復正常蛋白構(gòu)象及協(xié)助新合成的蛋白發(fā)生正確折疊，這個過程稱為線粒體非折疊蛋白反應（mitochondrial unfolded protein responses，UPRmt）[9]。UPRmt是一種高度保守的適應性應激反應通路[10]，其本質(zhì)是監(jiān)測線粒體內(nèi)的“異自者”（proteostasis），并且激活復雜的線粒體蛋白質(zhì)量控制網(wǎng)絡信號系統(tǒng)，根據(jù)微環(huán)境變化做出相應的反應，以確保線粒體蛋白組的最佳質(zhì)量和功能，維持線粒體功能完整[11]，從而維持骨骼肌細胞內(nèi)代謝穩(wěn)態(tài)。

因此，了解UPRmt對運動性骨骼肌的適應性表型變化的影響，對于揭示運動性骨骼肌新陳代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機制有重要意義。同時，有效控制該途徑可能為防治神經(jīng)退行性疾病、肌肉功能異常、肥胖和II型糖尿病等代謝疾病發(fā)生，以及線粒體等相關(guān)疾病的病理機制及防治措施提供新的理論依據(jù)[11]。

1 UPRmt的信號調(diào)控途徑

Zhao等[12]研究了超表達線粒體基質(zhì)定位的末端錯誤折疊的鳥苷酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ornithine transcarbamylase，OTC）后發(fā)現(xiàn)，線粒體基質(zhì)中非折疊蛋白的存在促進了線粒體分子伴侶HSP60、HSP10、mtDnaJ和ClpP（caseinolytic protease）的基因表達，參與蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的正確折疊，降解體內(nèi)受到損傷的蛋白質(zhì)，最終促進線粒體蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡，對維持機體代謝平衡具有重要意義。這里值得注意的是，細胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶基因表達均未發(fā)生變化，提示UPRmt具有特異性。研究證實，HSP60、mtDnaJ和ClpP基因的啟動子區(qū)均含有線粒體應激反應元件CHOP[transcription factor 4（ATF4）-ATF3-C/EBP homologous protein]，CHOP是C/EBP[CCAAT/enhancer-binding protein（C/EBP）-homologous protein]的同源蛋白[12]。線粒體在氧化應激過程中，CHOP基因表達上調(diào)，提示CHOP在UPRmt的信號途徑中具有關(guān)鍵作用[12]。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞毒性、亞砷酸鹽等也可激活CHOP[16]。有趣的是，CHOP啟動子區(qū)含有激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的結(jié)合位點，該結(jié)合位點對于CHOP在線粒體未折疊蛋白反應中的作用必不可少[13]。而c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）是一種能夠激活AP-1的關(guān)鍵上游蛋白激酶，可通過磷酸化c-Jun增強AP-1的轉(zhuǎn)錄活性[14]。線粒體非折疊蛋白應激的增加還可促進JNK2磷酸化，為JNK2在CHOP活化過程中的作用提供進一步支持[15]。磷酸化的JNK2與c-Jun結(jié)合后激活CHOP，繼而誘發(fā)線粒體分子伴侶基因，如線粒體UPR元件（mitochondrial UPR elements，MUREs）相關(guān)基因的表達[12]。MUREs存在于復雜的線粒體分子伴侶和蛋白酶基因的啟動子中，但與MUREs結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子目前還不是很清楚。同樣，其它一些問題，例如細胞如何在線粒體基質(zhì)中感知非折疊蛋白？在線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)中信號如何轉(zhuǎn)導？以及CHOP抑制劑減弱線粒體分子伴侶表達的機制等，還需要進一步研究。

研究顯示，線粒體膜間腔（the intermembrane space，IMS）也存在獨特的UPRmt信號途徑[16]。線粒體膜間腔突變核酸內(nèi)切酶G（endonuclease G，EndoG）的高表達可導致蛋白激酶B（protein kinase B，PKB or AKT）磷酸化和雌激素α（estrogen receptor alpha，ERα）活化，最終引起膜間腔特異的質(zhì)量控制蛋白酶HtrA2和NRF1（NF-E2-related factor 1）轉(zhuǎn)錄因子的表達均顯著增加[16]。此外，在應激狀態(tài)下，線粒體膜間腔蛋白酶體活性增加，提示線粒體膜間腔特異蛋白在輸入線粒體之前有泛化素修飾[16]，但其信號通路具體機制尚待探討。

為了進一步研究UPRmt的分子信號通路，Wrobel等[17]用線蟲為模型進行研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子ATFS-1在線粒體應激時參與UPRmt信號調(diào)控。ATFS-1包含線粒體靶序列和細胞核定位序列，通常情況下，ATFS-1進入線粒體快速分解，但是在線粒體應激時，ATFS-1的線粒體輸入顯著下降，導致許多線粒體靶蛋白聚集在細胞質(zhì)中，絕大多數(shù)被蛋白酶識別并降解，以預防錯誤位置蛋白積累的毒性[18]。但由于ATFS-1還含有一個細胞核定位序列，故其可穿透到細胞核激活UPRmt[19]，但其具體機制還需要進一步研究。

2 UPRmt與線粒體自噬及線粒體蛋白質(zhì)量控制之間的關(guān)系

研究顯示，如果線粒體嚴重受損或死亡會通過自噬途徑被清除[20]。線粒體自噬（mitophage）是由PINK1（PTEN induced putative kinase 1）分子誘導發(fā)生，其機制是PINK1聚集在去極化的線粒體外膜，募集E3泛素連接酶Parkin（E3 ubiquitin ligase Parkin）啟動自噬下游機制，然后和溶酶體融合與降解[21]。而UPRmt是一種翻譯應答，是通過增加線粒體特異性分子伴侶和蛋白酶，促進細胞器蛋白動態(tài)平衡的恢復[12]。有趣的是，引起線粒體自噬與激活UPRmt的應激源是相同的，譬如損傷線粒體DNA、呼吸鏈和線粒體核蛋白體基因突變和呼吸鏈抑制劑百草枯、魚藤酮等應激源[22]。但其作用途徑和時間點有所不同。UPRmt通過上調(diào)保護性成分，重塑細胞器蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡，最終提高線粒體功能；而線粒體自噬是清除已損傷的或有缺陷的細胞器。UPRmt活化可發(fā)生在線粒體自噬途徑之前，盡管UPRmt途徑已經(jīng)活化，但是如果細胞器不能維持膜電位，那么損傷的細胞器將會進入線粒體自噬途徑，最后如果線粒體損傷太多，細胞將進入凋亡。故關(guān)于二者之間途徑的交匯及機制還需研究。

線粒體基質(zhì)中含有特異的分子伴侶HSP60和HSP70[23]，HSP60主要促進相對小的、可溶的、單體蛋白的折疊[24]；而HSP70可執(zhí)行多種功能，當多肽鏈穿越線粒體膜時，首先HSP70以一種高能構(gòu)象結(jié)合前導肽鏈，然后松弛為一種低能構(gòu)象，使前導肽鏈進入，并促使后面的肽鏈解鏈以進入轉(zhuǎn)運軌道，進入線粒體基質(zhì)[25]；當多肽鏈進入基質(zhì)中時，HSP70作為折疊因子，促進蛋白折疊預防聚集[26]。但到目前為止，還沒有在線粒體膜間腔發(fā)現(xiàn)有分子伴侶HSP60或HSP70的家族成員[27]。

除了分子伴侶外，線粒體還含有幾種控制蛋白酶，包括膜間腔-與多種細胞活性相關(guān)的ATP酶（intermembrane space-ATPase Associated with diverse cellular Activities，i-AAA）和 基質(zhì)（腔）-與多種細胞活性相關(guān)的ATP酶（matrix-ATPase Associated with diverse cel-lular Activities，m-AAA），這些酶的作用是識別、降解不能正確折疊或聚集的蛋白質(zhì)，對于維持機體的正常代謝和適應各種應激反應起著重要作用[28]。此外，UPRmt還包含許多抗氧化基因，如線粒體超氧化物歧化酶和谷胱甘肽，這些抗氧化物可以預防線粒體源ROS引起的蛋白質(zhì)和細胞膜的損傷[19]。蛋白翻譯水平的增加和抗氧化酶活性的增強不僅促進了細胞器功能，同時也為可挽救的細胞器的恢復或再生提供了條件，穩(wěn)固了蛋白折疊的內(nèi)在環(huán)境，而不可修復的細胞器通過線粒體自噬進行降解[29]。

3 UPRmt與骨骼肌代謝

骨骼肌不僅是機體最大的蛋白質(zhì)儲存庫，也是能量需求的重要器官，尤其在肌肉收縮或運動時，能量需求急劇增加，所需能量主要來自于線粒體的氧化代謝[2]。線粒體是生物氧化和能量交換的主要場所，不僅進行三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OxPhos）產(chǎn)生ATP，為生命活動提供能量和生物合成底物，而且在氨基酸、脂質(zhì)和核苷酸的物質(zhì)代謝過程中也起著重要作用[30]。氧化磷酸化是釋放代謝能的主要環(huán)節(jié)，此過程涉及mtDNA編碼的一些線粒體蛋白質(zhì)如電子傳遞鏈酶復合體中的亞基，包括電子傳遞鏈復合體I～IV，分別是NADH-CoQ氧化還原酶、琥珀酸-CoQ氧化還原酶、CoQH2C-細胞色素C氧化還原酶、細胞色素C氧化酶和ATP合酶復合體；同時，mtDNA還可以編碼線粒體的tRNA、rRNA，這些RNA對蛋白質(zhì)的合成至關(guān)重要[31]。最近研究顯示，UPRmt涉及多種細胞代謝途徑包括糖酵解和氨基酸分解代謝[32]。UPRmt可抑制三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化轉(zhuǎn)錄物的積累，調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯匹配，以確保電子傳遞鏈復合物的高效合成、裝配和生物發(fā)生，同時通過增加糖酵解相關(guān)基因的表達維持ATP的增長，減輕線粒體應激或改善新陳代謝狀態(tài)以促進細胞生存[32]。

研究顯示，UPRmt活性增加可恢復或延長骨骼肌線粒體的功能和延長壽命[33]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是線粒體氧化還原過程中的必需輔酶，在TCA、OxPhos過程中起核心樞紐作用，其主要作用是可逆接受電子和H離子，保持線粒體膜電位，保證ATP的產(chǎn)生。研究顯示，衰老小鼠骨骼肌[34]和高脂高糖膳食小鼠肝臟[15]NAD含量顯著下降，而通過基因方法或藥學方法可明顯增加NAD水平，明顯改善線粒體功能，甚至延長壽命[15]。其作用機制可能是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），激活去乙酰化酶（sirtuin，SIRT），介導轉(zhuǎn)錄因子 PGC-1α和FOXO3所致。同時，NAD水平增加可激活UPRmt。

綜上所述，UPRmt的活化可以精準協(xié)調(diào)OxPhos和TCA的基因表達和匹配蛋白折疊，以恢復線粒體功能，同時可增加線粒體蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的能力。有趣的是，UPRmt可通過限制TCA活性而使NAD/NADH保持高水平狀態(tài)一直保持到線粒體活性的恢復，此時，TCA循環(huán)的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄可開始表達[35]。

4 UPRmt與骨骼肌運動適應

骨骼肌不僅是機體的運動器官，也是細胞能量代謝的重要場所。骨骼肌運動收縮時，其能量需求急劇增加，因此，骨骼肌線粒體能量的高效產(chǎn)出和穩(wěn)定供給是維持骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)的重要保證[2]。研究表明，線粒體直接應答運動引起的氧耗、ATP需求的增加，發(fā)生適應自身結(jié)構(gòu)與功能的表型變化，同時自身也產(chǎn)生一部分蛋白質(zhì)，對細胞、組織、器官乃至機體的運動適應表型改變都發(fā)揮著調(diào)控作用[3]，但其潛在的分子機制尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，運動性骨骼肌線粒體發(fā)生表型改變與UPRmt密切相關(guān)[36]。Memme等[11]對大鼠脛骨前?。╰ibialis anterior，TA）和趾長伸?。╡xtensor digitorum longus，EDL）分別進行1、2、3、5、7天的電刺激（頻率10赫茲，電壓6伏，脈沖0.1毫秒，每分鐘間歇999毫秒，每天刺激3小時）模擬耐力運動（持續(xù)7天刺激相當于6周耐力運動），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UPRmt相關(guān)蛋白ClpP的mRNA表達均顯著增加，尤其是運動第2天，增加了70%，第5天和第7天均增加了45%，此蛋白對未折疊的基質(zhì)蛋白能感知并做出相應反應。同時，線粒體調(diào)控蛋白Sirtuin 3的蛋白表達于2～7天均顯著增加，線粒體分子伴侶 CPN10（mitochondrial chaperones 10-kDa chaperonin）、HSP60和HSP70的mRNA表達均顯著增加，HSP60和CPN10的蛋白表達也顯著增加，線粒體轉(zhuǎn)錄因子CHOP的mRNA和蛋白表達于1～7天均顯著增加，這些結(jié)果均提示UPRmt對機械刺激非常敏感，并且對機械刺激保持一個適應狀態(tài)。因此，UPRmt可能在運動性骨骼肌線粒體適應重塑過程中具有積極作用。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞的運動負荷過度時，線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)可能發(fā)生錯誤折疊，此時，UPRmt被激活，通過一系列應激保護機制提高線粒體功能，保護細胞維持動態(tài)平衡，以維持骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)[9]。但也有相反的報道，Kim等[37]對大鼠分別進行中等強度運動（坡度10°運動速度20 m/min，每次持續(xù)時間 60 min，共5周）和大強度運動（坡度10°，運動速度34 m/min，每次持續(xù)時間 60 min，共5周），結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩運動組大鼠腓腸肌UPRmt相關(guān)蛋白CHOP mRNA水平均顯著下降，其中大強度運動組比中等強度運動組下降得更明顯，其具體機制還需要進一步研究。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，UPRmt是一種應激反應信號途徑，在線粒體基質(zhì)積累或產(chǎn)生大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)時激活，上調(diào)控制核基因編碼的線粒體分子伴侶蛋白HSP60、HSP70等基因的表達，幫助發(fā)生錯誤折疊的蛋白恢復正常蛋白構(gòu)象及協(xié)助新合成的蛋白發(fā)生正確折疊，將信號從線粒體轉(zhuǎn)導至細胞核，此過程有助于維持線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡和細胞存活。到目前為止，UPRmt介導的保護作用主要體現(xiàn)在代謝調(diào)節(jié)，因此，UPRmt有可能是有效防治胰島素抵抗、肥胖和II型糖尿病等代謝疾病發(fā)生的靶點之一。運動通過增強UPRmt信號通路進一步鞏固和優(yōu)化線粒體功能，維持骨骼肌質(zhì)量和功能完整性，從而穩(wěn)定骨骼肌代謝功能的穩(wěn)態(tài)。

臨床和動物實驗研究均已證實運動能夠激活UPRmt通路，從而調(diào)節(jié)線粒體分子伴侶、線粒體自噬和OxPhos及TCA相關(guān)基因的表達，穩(wěn)定線粒體蛋白質(zhì)代謝和能量代謝平衡，維持骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)。因此，URP-mt可能是運動性骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)的重要介導因子之一（圖1）。

圖1 UPRmt介導的運動性骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)示意圖

但目前有關(guān)運動性UPRmt調(diào)節(jié)骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)的分子信號機制還存在一些亟待研究和探討的問題：（1）線蟲UPRmt的調(diào)控主要依靠轉(zhuǎn)錄因子ATFS-1，但哺乳動物是否也依賴ATFS-1途徑還不清楚。（2）長期規(guī)律性運動可否使UPRmt和線粒體自噬更好地適應骨骼肌代謝和線粒體蛋白質(zhì)量控制機制；（3）對UPRmt調(diào)控CHOP mRNA的相反報道有待深入探討其原因；（4）UPRmt信號調(diào)控是通過線粒體的蛋白輸入效率還是通過一種自主選擇方式進行；UPRmt信號激活后，非折疊蛋白如何識別信號分子等問題也需進一步探討。

研究發(fā)現(xiàn)[38]，酵母轉(zhuǎn)錄因子ATFS-1包含一個線粒體靶序列（a mitochondrial targeting sequence，MTS）和一個核定位序列（a nuclear localization sequence，NLS），當氧氣和血紅素少的時候，其被激活，促進血紅素形成。因為許多哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子中含有MTS，并且位于線粒體中，我們可以推測其可能有相似的調(diào)控方式。也許ClpP可充當應激感受器，對主要蛋白折疊缺陷提出“異議”，從而“識別”線粒體是變更還是重組，上述情況在運動應激狀態(tài)下是否還成立，尚需進一步研究。深入探析和解決這些問題，將會進一步揭示運動介導的UPRmt在調(diào)節(jié)骨骼肌代謝穩(wěn)態(tài)中的重要作用。