獼猴桃酒發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分變化及發(fā)酵方式對(duì)成品酒品質(zhì)的影響

王 靜，徐俊南，常婷婷，樊明濤*

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

我國是目前世界上最大的獼猴桃生產(chǎn)國，每年產(chǎn)量約106萬t，占全球總產(chǎn)量的38%[1]。獼猴桃營養(yǎng)豐富并具有高抗氧化活性，其高抗氧化活性與果實(shí)中的多酚、VC、多糖等活性物質(zhì)密切相關(guān)。PARK Y S等[2]研究發(fā)現(xiàn)多酚類對(duì)獼猴桃的抗氧化活性影響最大，VC次之，多糖最小。但獼猴桃屬于呼吸躍變型水果，容易腐敗變質(zhì)，每年都有大量的果實(shí)浪費(fèi)。在產(chǎn)地將獼猴桃發(fā)酵成果酒，既避免了浪費(fèi)又增加了產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值[3]。

獼猴桃酒是指用新鮮獼猴桃經(jīng)酵母發(fā)酵得到的果酒。獼猴桃酒不僅色澤清亮，味甘醇和，而且保留了果實(shí)中大量的營養(yǎng)物質(zhì)。其中多酚類物質(zhì)具有抗氧化[4]、降血壓、降血脂等保健功能。VC是最重要的親水性抗氧化劑[5]，能有效清除超氧陰離子自由基、羥基自由基和單線態(tài)氧等，并且可以被人體直接吸收利用。單寧也具有抗血栓形成、抗癌[6]、抗炎[7]和抗病毒等性能[8-9]。同時(shí)，這些營養(yǎng)物質(zhì)與酒體的感官品質(zhì)有關(guān)，水果中的多酚類物質(zhì)對(duì)酒體顏色、口感有明顯的影響[10]，單寧能沉淀蛋白質(zhì)、穩(wěn)定色素、改善酒體澀味，提高圓潤感[11-12]。

皮渣包括果皮、果渣和種子。獼猴桃皮渣含有大量的多酚、黃酮及多糖等物質(zhì)[13]。YULIARTI O等[14]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃皮渣的質(zhì)量約是整個(gè)果實(shí)的40%～50%，獼猴桃皮渣與獼猴桃果實(shí)相比，蛋白含量相近，但中性多糖的含量是其2倍以上。焦巖等[15]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃皮黃酮提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長均有很好的抑制效果。目前關(guān)于獼猴桃酒清汁發(fā)酵與帶渣發(fā)酵的對(duì)比研究較少，因此，本試驗(yàn)主要研究獼猴桃酒主發(fā)酵過程中多酚、VC和單寧含量的變化，以及帶渣發(fā)酵對(duì)獼猴桃酒品質(zhì)的影響，從而增加對(duì)獼猴桃酒潛在健康益處的了解，為獼猴桃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用獼猴桃（海沃德、秦美、紅陽3個(gè)品種）：購于陜西省楊凌農(nóng)貿(mào)市場；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WLP775：保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品微生物與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；1,1-二苯-1-苦基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS）、兒茶素和沒食子酸：美國Sigma公司；果膠酶（40 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；甲基纖維素（40 000 mPa·s）：上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸、氫氧化鈉、碳酸鈉及過硫酸鉀等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

榨汁機(jī)：南通金橙機(jī)械有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；手持糖度儀：福建泉州光學(xué)儀器廠；HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋、DH-420A電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；HS-840型水平層流單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃酒的釀造

本試驗(yàn)采用海沃德、秦美和紅陽3種獼猴桃為原料，分別采用清汁和帶渣發(fā)酵，釀造6種獼猴桃酒，分別為海沃德清汁發(fā)酵酒（HWD-Q）、海沃德帶渣發(fā)酵酒（HWD-Z）、秦美清汁發(fā)酵酒（QM-Q）、秦美帶渣發(fā)酵酒（QM-Z）、紅陽清汁發(fā)酵酒（HY-Q）、紅陽帶渣發(fā)酵酒（HY-Z），具體釀造工藝如下：

挑選新鮮成熟獼猴桃分別榨汁和打漿，裝入發(fā)酵罐，同時(shí)添加60 mg/L SO2和50 mg/L果膠酶，常溫下酶解24 h，按4%的接種量接入事先活化好的釀酒酵母，常溫下發(fā)酵10 d，每天測定可溶性固形物，隔天留樣。當(dāng)可溶性固形物基本保持不變時(shí)，倒罐并加入60 mg/L SO2，結(jié)束酒精發(fā)酵。

1.3.2 獼猴桃酒基本理化指標(biāo)的測定

酒精度的測定參照GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》；可滴定酸（以蘋果酸計(jì)）、pH值及可溶性固形物的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；還原糖（以葡萄糖計(jì)）的測定采用DNS比色法[16]。

1.3.3 總多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法[17]進(jìn)行測定，結(jié)果以沒食子酸計(jì)。

1.3.4 VC含量的測定

采用2,6-二氯靛酚滴定法，具體參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.5 單寧含量的測定

參照SARNECKIS C J等[18]的方法并改進(jìn)。在10 mL離心管中加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的樣品，加入3 mL 0.04%甲基纖維素溶液上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次后靜置2 min（對(duì)照組不加甲基纖維素溶液），加入2 mL飽和硫酸銨溶液，用去離子水定容到10 mL。室溫條件下反應(yīng)10 min后，于6 000 r/min條件下離心5 min棄沉淀，波長280 nm處測定吸光度值，樣品中單寧的吸光度值為對(duì)照組吸光度值減去樣品組的吸光度值，結(jié)果以兒茶素表示。

1.3.6 獼猴桃酒體外抗氧化能力的測定

還原能力參照WU Q等[19]的方法，反應(yīng)液吸光值越大表明樣品還原能力越強(qiáng)；DPPH自由基清除率參照CUMBY N等[20]的方法；ABTS+·清除率參照PARK Y S等[21]的方法。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel繪圖；SPSS20.0進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。所有樣品均平行測定3次，測定結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃酒基本理化指標(biāo)

發(fā)酵完成后6種不同獼猴桃酒的基本理化指標(biāo)見表1。由表1可知，6種獼猴桃酒的可溶性固形物含量在6.00%～6.90%，還原糖在4.67～7.08g/L，酒精度在4.83%vol～6.00%vol，基本屬于低度干型果酒。清汁酒的可溶性固形物含量、還原糖含量較帶渣酒低，這可能是因?yàn)槠ぴ杏懈嗟奶穷惤n到發(fā)酵體系中。pH值為3.23～4.19，可滴定酸為9.39～19.72 g/L，和其他果酒基本相似。海沃德與秦美清汁酒的可滴定酸較帶渣酒的高，紅陽酒與之相反，這可能與獼猴桃品種有關(guān)[22-23]，且清汁酒發(fā)酵過程中酵母菌代謝更旺盛，積累了更多的有機(jī)酸。過高的酸度對(duì)酒的口感、柔和度都有一定的影響，所以對(duì)發(fā)酵結(jié)束后的獼猴桃酒進(jìn)行降酸處理，有助于提高果酒的品質(zhì)[24]。

表1 六種不同獼猴桃酒的基本理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of six kinds of kiwi wines

2.2 獼猴桃酒發(fā)酵過程中可溶性固形物的變化

獼猴桃酒發(fā)酵過程中可溶性固形物含量的變化見圖1。由圖1可知，發(fā)酵前3 d，可溶性固形物含量基本保持不變，發(fā)酵第3～7天，可溶性固形物含量快速降低，第7天以后基本保持不變，且?guī)гl(fā)酵酒的可溶性固形物降速高于對(duì)應(yīng)的清汁發(fā)酵酒，這說明帶渣發(fā)酵能提高發(fā)酵速率。酒精發(fā)酵初始階段，酵母菌適應(yīng)環(huán)境并增殖，消耗糖類較少，可溶性固形物下降較慢，當(dāng)酵母增殖到較大細(xì)胞量時(shí)，消耗糖量的速度大大加快，固形物含量快速下降至較低濃度。發(fā)酵后期，體系中基本不含酵母菌可利用的糖，可溶性固形物含量基本保持不變。此時(shí)對(duì)酒進(jìn)行皮渣分離，結(jié)束酒精發(fā)酵。

圖1 獼猴桃酒發(fā)酵過程中可溶性固形物含量的變化Fig.1 Changes of soluble solids contents during kiwi wine fermentation

2.3 獼猴桃酒發(fā)酵過程中總多酚含量的變化

獼猴桃酒發(fā)酵過程中總多酚含量的變化見圖2。由圖2可知，6種獼猴桃酒總多酚含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長變化不同。海沃德和紅陽酒的總多酚含量維持在0.8 g/L左右，秦美酒的總多酚含量則經(jīng)歷了先降低后升高最后又降低的過程。這種差異可能與不同品種獼猴桃中總多酚的初始含量有關(guān)。酒精發(fā)酵過程中總多酚含量的變化主要與發(fā)酵體系、多酚類物質(zhì)的浸提以及多酚參與的生化反應(yīng)等有關(guān)[25]。在發(fā)酵過程中，酵母菌繁殖不斷的產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，有利于多酚類物質(zhì)的浸提，另一方面，多酚易氧化分解且能以疏水鍵、多重氫鍵與蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞膜等生物大分子相結(jié)合，黃惠華等[26]研究發(fā)現(xiàn)由于酒精發(fā)酵產(chǎn)熱，體系乙醇濃度不斷增加，與蛋白質(zhì)絡(luò)合態(tài)的多酚量不斷增加，導(dǎo)致試驗(yàn)檢測到的總多酚含量減少。另外，發(fā)酵過程中除個(gè)別點(diǎn)外，帶渣發(fā)酵酒的總多酚含量均高于對(duì)應(yīng)的清汁發(fā)酵酒。

圖2 獼猴桃酒發(fā)酵過程中總多酚含量的變化Fig.2 Changes of total polyphenols contents during kiwi wine fermentation

2.4 獼猴桃酒發(fā)酵過程中VC含量的變化

圖3 獼猴桃酒發(fā)酵過程中VC含量的變化Fig.3 Changes of VC contents during kiwi wine fermentation

獼猴桃酒發(fā)酵過程中VC含量的變化見圖3，由圖3可知，不同品種和發(fā)酵方法得到的獼猴桃酒VC含量變化不同。海沃德和紅陽清汁酒的VC含量在發(fā)酵初期不斷升高，后期不斷降低，而其他4種酒的VC含量在發(fā)酵前兩天降低，之后升高，6 d之后再次降低。這可能是由于在發(fā)酵前期，清汁發(fā)酵有利于VC的浸提，海沃德和紅陽清汁酒的VC含量有所升高。VC是一種較不穩(wěn)定的水溶性維生素，在發(fā)酵體系中可通過氧化和非氧化反應(yīng)降解[27-28]，且?guī)гl(fā)酵不利于VC的浸提，所以帶渣酒的VC含量降低。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液的低含氧量、低pH（3.68～4.06）以及大量的類黃酮類物質(zhì)都有利于保持VC的穩(wěn)定性，含量有所上升。發(fā)酵后期，光和熱導(dǎo)致VC不斷氧化分解，含量降低。

2.5 獼猴桃酒發(fā)酵過程單寧含量的變化

圖4 獼猴桃酒發(fā)酵過程中單寧含量的變化Fig.4 Changes of tannin contents during kiwi wine fermentation

獼猴桃酒發(fā)酵過程中單寧含量的變化見圖4。由圖4可知，獼猴桃酒發(fā)酵過程中海沃德和秦美帶渣酒的單寧含量分別在發(fā)酵前4 d和前2 d升高，之后快速降低，其余4種酒的單寧含量在發(fā)酵前6 d持續(xù)降低，最后都維持在一個(gè)較低水平。酒中的單寧含量與釀造過程中單寧的浸提密切相關(guān)，發(fā)酵前的低溫浸漬有利于單寧的浸提，所以發(fā)酵初期，帶渣酒的單寧含量較清汁酒高[29]。發(fā)酵過程中單寧含量的降低可能是單寧的氧化、沉淀或者縮合反應(yīng)引起的，該試驗(yàn)結(jié)果與ZHANG Y等[25]研究葡萄酒發(fā)酵過程中單寧含量變化結(jié)果相一致。

2.6 帶渣浸漬對(duì)獼猴桃成品酒多酚、單寧及VC含量的影響

不同品種獼猴桃酒（發(fā)酵10 d）總多酚、單寧以及VC含量的比較結(jié)果見圖5。由圖5可知，清汁酒與帶渣酒的總多酚、單寧及VC含量均存在顯著性差異（P＜0.05），帶渣發(fā)酵能顯著提高酒中的總多酚和單寧含量，這與áIVAREZ I等[12，30-31]研究結(jié)果一致。水果皮渣含有大量的酚酸、黃酮及多糖等活性物質(zhì)[32]，發(fā)酵過程中，由于酵母活動(dòng)和浸漬作用，皮渣中的營養(yǎng)成分逐漸溶解到發(fā)酵液中，能有效的提高這些物質(zhì)在酒中的含量。獼猴桃鮮果的VC含量為100～400 mg/100 g[33]，不同的獼猴桃品種VC含量差異較大，由圖5C可知，帶渣酒的VC含量顯著低于清汁酒（P＜0.05），這可能與VC的性質(zhì)和酒發(fā)酵結(jié)束后的皮渣分離有關(guān)。

圖5 不同種獼猴桃酒總多酚（A）、單寧（B）及VC（C）含量的比較Fig.5 Comparison of contents of total polyphenols(A),tannin(B)and VC(C)contents in six kinds of kiwi wines

2.7 帶渣浸漬對(duì)獼猴桃成品酒抗氧化活性的影響

由圖6可知，6種獼猴桃酒還原力的吸光度值為0.17～0.46，DPPH清除率為60.81%～95.04%，ABTS+·清除率為5.35%～20.26%。帶渣酒的還原力均顯著大于清汁酒（P＜0.05），這與獼猴桃酒中總多酚含量結(jié)果一致。DPPH、ABTS+·清除率根據(jù)不同的獼猴桃品種和發(fā)酵方法表現(xiàn)出不同的結(jié)果，這可能由于不同的獼猴桃酒中總多酚和VC等抗氧化物的含量不同，不同自由基清除反應(yīng)的機(jī)理不同。2.8獼猴桃酒活性物質(zhì)含量與抗氧化活性相關(guān)分析

圖6 不同種獼猴桃酒抗氧化活性的比較Fig.6 Comparison of antioxidant activities of different kiwi wines

獼猴桃酒活性物質(zhì)含量與抗氧化活性相關(guān)分析結(jié)果見表2。由表2可知，獼猴桃酒總多酚含量和酒體還原力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與DPPH清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。VC含量與還原力、DPPH及ABTS+·呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。這表明獼猴桃酒的抗氧化活性與酒體中的多酚和VC有關(guān)，多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中均含有活性羥基，能夠提供電子，表現(xiàn)出還原力和清除自由基的能力，VC在C3、C4含有烯二醇結(jié)構(gòu)，這是VC具有抗氧化活性的主要原因[26]。單寧含量對(duì)酒體抗氧化活性影響不大，這可能由于單寧在獼猴桃酒中的含量較少。

表2 獼猴桃酒活性物質(zhì)含量與抗氧化活性相關(guān)分析Table 2 Correlation between active substance contents and antioxidant activities of kiwi wines

3 結(jié)論

獼猴桃品種及發(fā)酵方法對(duì)獼猴桃酒發(fā)酵過程中總多酚、VC及單寧含量的變化以及在獼猴桃成品酒中的含量、成品酒的抗氧化活性都有一定的影響。

其中，獼猴桃品種對(duì)總多酚含量的變化影響較大，海沃德和紅陽品種酒的多酚含量基本保持不變，秦美酒則經(jīng)歷了先降低后升高最后又降低的過程。發(fā)酵方法對(duì)VC、單寧含量的變化影響較大，除秦美清汁酒外，海沃德和紅陽清汁酒的VC含量先升高后降低，而3種帶渣酒的VC含量先降低再升高，最后再降低，3種清汁酒的單寧含量不斷降低，最后維持在一個(gè)較低水平，而海沃德和秦美帶渣酒的單寧含量先升高再降低，最后基本保持不變。另外，帶渣發(fā)酵能提高酒體總多酚和單寧含量、降低VC含量，能提高酒體還原力，但對(duì)DPPH、ABTS+·清除率沒有顯著影響。

多酚、VC以及單寧對(duì)獼猴桃酒的營養(yǎng)品質(zhì)和感官品質(zhì)都有重要的影響，研究發(fā)酵過程中總多酚、VC及單寧的變化以及在成品酒中的含量、成品酒的抗氧化活性對(duì)于提高獼猴桃酒的品質(zhì)有十分重要的意義，但是關(guān)于發(fā)酵過程中多酚、VC及單寧變化的機(jī)理需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。